Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Overgang en zware metalen, zoals Zn, Cu, MN, en Fe, zijn van nature in het milieu gevonden in zowel voedingsstoffen in voedsel en verontreinigende stoffen. Alle levende organismen vereisen verschillende hoeveelheden van deze micronutriënten; echter, blootstelling aan hoge niveaus is schadelijk voor organismen. Metal acquisitie is voornamelijk door het dieet, maar metalen kunnen ook worden ingeademd of geabsorbeerd door de huid^1,2,3,4,5. Het is belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van metalen in atmosferische deeltjes neemt toe en is grotendeels geassocieerd met gezondheidsrisico’s. Wegens antropogene activiteiten, zijn de verhoogde niveaus van zware metalen zoals AG, zoals, cd, CR, Hg, ni, Fe, en PB ontdekt in atmosferische deeltjes kwestie, regenwater, en grond^6,7. Deze metalen hebben het potentieel om te concurreren met essentiële fysiologische sporenelementen, met name Zn en Fe, en ze veroorzaken toxische effecten door het inactiveren van fundamentele enzymen voor biologische processen.

Het spoorelement Zn is redox neutraal en gedraagt zich als een Lewis zuur in biologische reacties, waardoor het een fundamentele cofactor die nodig is voor eiwit vouwen en katalytische activiteit in meer dan 10% van zoogdieren eiwitten^{8,9, 10}; Bijgevolg is het essentieel voor diverse fysiologische functies^8,11. Echter, net als vele sporenelementen, is er een delicaat evenwicht tussen deze metalen vergemakkelijken van de normale fysiologische functie en het veroorzaken van toxiciteit. Bij zoogdieren, Zn tekortkomingen leiden tot anemie, groeivertraging, hypogonadisme, huidafwijkingen, diarree, alopecia, smaakstoornissen, chronische ontsteking, en verminderde immuun-en neurologische functies^{11,12, 13,14,15,16,17,18}. In overmaat, Zn is chemo en schaadt de absorptie van andere essentiële metalen zoals koper^19,20,21.

Bovendien, sommige metalen zoals Cu en FE hebben het potentieel om deel te nemen aan schadelijke reacties. Productie van reactieve zuurstof soorten (Ros) via Fenton chemie kan interfereren met de assemblage van ijzerzwavel cluster eiwitten en Alter lipide metabolisme^22,23,24. Om deze schade te voorkomen gebruiken cellen metaal-bindende chaperones en transporteurs om toxische effecten te voorkomen. Ongetwijfeld, metaal homeostase moet strak worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat specifieke soorten cellen te handhaven goede niveaus van metalen. Om deze reden, is er een significante behoefte om technieken voor nauwkeurige meting van spoormetalen in biologische steekproeven vooruit te gaan. Bij het ontwikkelen en rijpen van organismen bestaat er een differentiële biologische behoefte aan sporenelementen op cellulair niveau, in verschillende ontwikkelingsstadia, en in normale en pathologische omstandigheden. Daarom, nauwkeurige bepaling van weefsel en systemische metaal niveaus is noodzakelijk om organisch metaal homeostase te begrijpen.

Graphite Furnace atomaire absorptiespectrometrie (GF-aas) is een zeer gevoelige techniek die wordt gebruikt voor kleine monster volumes, waardoor het ideaal is om de overgang en zware metalen aanwezig zijn in biologische en milieu-monsters te meten^{25,26 , 27 , 28}. Bovendien is het vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek aangetoond dat het geschikt is voor het bestuderen van de fijne transport eigenschappen van na⁺/K⁺-ATPase en maag H⁺/K⁺-ATPase met behulp van Xenopus oöcyten als modelsysteem²⁹. In GF-AAS, absorberen de verstoven elementen binnen een steekproef een golflengte van straling die door een lichtbron wordt uitgezonden die het metaal van belang bevat, met de geabsorbeerde straling evenredig aan de concentratie van het element. Elementaire elektronische excitatie vindt plaats bij absorptie van ultraviolette of zichtbare straling in een gequanteerd proces uniek voor elk chemisch element. In een enkel elektron proces, de absorptie van een foton gaat om een elektron verplaatsen van een lager energieniveau naar een hoger niveau binnen het Atoom en GF-AAS bepaalt de hoeveelheid fotonen geabsorbeerd door het monster, dat evenredig is aan het aantal straling absorberen elementen verstoven in de grafiet buis.

De selectiviteit van deze techniek berust op de elektronische structuur van de atomen, waarin elk element een specifieke absorptie/emissie spectrale lijn heeft. In het geval van Zn, de absorptie golflengte is 213,9 nm en kan precies worden onderscheiden van andere metalen. Globaal, kan GF-AAS worden gebruikt om Zn met adequate grenzen van opsporing (LOD) en hoge gevoeligheid en selectiviteit²⁵te kwantificeren. De veranderingen in de geabsorbeerde golflengte zijn geïntegreerd en gepresenteerd als pieken van energie-absorptie op specifieke en geïsoleerde golflengten. De concentratie van de Zn in een bepaald monster wordt meestal berekend op basis van een standaardkromme van bekende concentraties volgens de wet bier-Lambert, waarbij de absorptie direct evenredig is met de concentratie van Zn in het monster. Echter, de toepassing van de beer-Lambert vergelijking met GF-AAS analyses presenteert ook een aantal complicaties. Bijvoorbeeld, variaties in de verneveling en/of niet-homogene concentraties van de monsters kan invloed hebben op de metalen metingen.

De metalen verneveling vereist voor GF AAS Trace Elemental Analysis bestaat uit drie fundamentele stappen. De eerste stap is desolvatie, waar het vloeibare oplosmiddel wordt verdampt; het verlaten van droge verbindingen na de oven bereikt een temperatuur van rond 100 °C. Vervolgens worden de verbindingen verdampt door ze te verwarmen van 800 tot 1.400 °C (afhankelijk van het te analyseren element) en een gas te worden. Tot slot, de verbindingen in de gasvormige staat zijn verstoven met temperaturen die variëren van 1.500 tot 2.500 ° c. Zoals hierboven besproken, zal het verhogen van de concentraties van een metaal van belang evenredige stijgingen van de absorptie gedetecteerd door de GF-AAS, maar de oven vermindert het dynamisch bereik van de analyse, dat is het werkbereik van concentraties die kunnen worden bepaald door het instrument. Zo, de techniek vereist lage concentraties en een zorgvuldige bepaling van het dynamisch bereik van de methode door het bepalen van de LOD en de grens van lineariteit (LOL) van de beer-Lambert wet. De LOD is de minimumhoeveelheid die nodig is om een stof te kunnen detecteren, gedefinieerd als drie maal de standaarddeviatie van Zn in de matrix. De LOL is de maximale concentratie die kan worden gedetecteerd met behulp van bier-Lambert wet.

In dit werk beschrijven we een standaardmethode om de niveaus van Zn te analyseren in hele cel extracten, cytoplasma en nucleaire fracties, en in het verspreiden en differentiëren van gekweekte cellen (Figuur 1). We hebben de snelle isolatie van kernen protocol aangepast aan verschillende cellulaire systemen om metaal verlies te voorkomen tijdens het monster voorbereiding. De gebruikte cellulaire modellen waren primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, muizen neuroblastoma cellen (N2A of Neuro2A), muizen 3T3 L1 adipocyten, een menselijke niet-tumorigenic borst epitheel cel lijn (MCF10A), en epitheel Madin-Darby de Honds nier ( MDCK) cellen. Deze cellen werden gevestigd van verschillende lineages en zijn goede modellen voor het onderzoeken van Lineage specifieke variaties van metaal niveaus in vitro.

Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen vormen een goed geschikt in vitro model om skeletspier differentiatie te onderzoeken. De proliferatie van deze cellen is snel wanneer gekweekt onder hoge serum voorwaarden. Differentiatie in de gespierde afstamming wordt vervolgens geïnduceerd door lage serum condities³⁰. De muizen neuroblastoma (N2A) gevestigde cel lijn werd afgeleid van de muis neurale kuif. Deze cellen aanwezig neuronale en amoeboid stamcel morfologie. Bij differentiatie stimulus, de N2A cellen presenteren verschillende eigenschappen van neuronen, zoals neurofilaments. N2a cellen worden gebruikt om de ziekte van Alzheimer te onderzoeken, neuriet uitgroei, en neurotoxiciteit^31,32,33. De 3T3-L1 muizen pre-adipocyten gevestigde cel lijn wordt vaak gebruikt om de metabole en fysiologische veranderingen in verband met adipogenesis te onderzoeken. Deze cellen presenteren een fibroblast-achtige morfologie, maar eenmaal gestimuleerd voor differentiatie, ze presenteren enzymatische activering geassocieerd met lipide synthese en triglyceriden accumulatie. Dit kan worden waargenomen als morfologische veranderingen te produceren cytoplasma lipide druppeltjes^34,35. MCF10A is een niet-tumor borstklier epitheel cel lijn afgeleid van een premenopauzale vrouw met borstkanker fibrocystische ziekte³⁶. Het is op grote schaal gebruikt voor biochemische, moleculaire, en cellulaire studies met betrekking tot borst carcinogenese zoals proliferatie, cel migratie, en invasie. De Madin-Darby Canine nier (MDCK) epitheel cel lijn is uitvoerig gebruikt om de eigenschappen en moleculaire gebeurtenissen in verband met de oprichting van de epitheel fenotype te onderzoeken. Bij het bereiken van samenvloeiing, deze cellen worden gepolariseerd en vast te stellen cel-cel adhesies, kenmerken van zoogdier epitheelweefsels³⁷.

Om het vermogen van AAS te testen om de niveaus van Zn in zoogdiercellen te meten, analyseerden we hele en subcellulaire fracties (cytosol en Nucleus) van deze vijf cel lijnen. AAS metingen toonden verschillende concentraties van Zn in deze cel types. De concentraties waren lager in het vermenigvuldigen en het onderscheiden van primaire myoblasten (4 tot 7 nmol/mg van proteïne) en hoger in de vier gevestigde cel lijnen (die zich van 20 tot 40 nmol/mg van proteïne uitstrekken). Een kleine niet-significante stijging van Zn niveaus werd ontdekt in het onderscheiden van primaire myoblasten en neuroblastoma cellen in vergelijking met het vermenigvuldigen van cellen. Het tegenovergestelde effect werd ontdekt in onderscheiden adipocyten. Nochtans, vertoonden de vermenigvuldigende 3T3-L1 cellen hogere concentraties van het metaal in vergelijking met onderscheiden cellen. Belangrijk, in deze drie cel lijnen, subcellulaire fractionering toonde aan dat Zn is gedifferentieerd verdeeld in de cytosol en de kern volgens de metabole toestand van deze cellen. Bijvoorbeeld, in het verspreiden zich myoblasten, N2A cellen, en 3T3-L1 pre-adipocyten, is een meerderheid van het metaal gelokaliseerd aan de kern. Bij de inductie van differentiatie met behulp van specifieke cel behandelingen, Zn gelokaliseerd om de cytosol in deze drie soorten cellen. Interessant is dat beide epitheelcellen hogere niveaus van Zn toonden tijdens de proliferatie in vergelijking met bij het bereiken van samenvloeiing, waarin een karakteristieke strakke monolayer werd gevormd. In de proliferatie van Epitheelcellen, de borstklieren cel lijn MCF10A had een gelijke Zn verdeling tussen de cytosol en de kern, terwijl in de nier-afgeleide cel lijn, het grootste deel van het metaal was gelegen in de kern. In deze twee cellen, toen de cellen samenvloeiing bereikten, was Zn voornamelijk gelegen aan de cytosol. Deze resultaten tonen aan dat GF-AAS is een zeer gevoelige en accurate techniek voor het uitvoeren van elementaire analyse in lage opbrengst monsters. GF-AAS in combinatie met subcellulaire fractionering en kan worden aangepast aan de niveaus van sporenmetalen elementen in verschillende cellen en weefsels te onderzoeken.