Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

La destrucción de cultivos por enfermedades bacterianas y fúngicas da lugar a una menor producción de alimentos y puede perturbar gravemente la estabilidad mundial¹. Sobre la base del descubrimiento de que los microbios en suelos supresores son responsables de aumentar la salud vegetal², los científicos han preguntado si el microbioma vegetal puede ser aprovechado para apoyar el crecimiento de las plantas modificando la presencia y abundancia de particulares especies bacterianas³. Las bacterias que se encuentran para ayudar en el crecimiento o desarrollo de las plantas se denominan colectivamente bacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPB). Más recientemente, los estudios han pasado de identificar simplemente el PGPB potencial a entender cómo las interacciones interkingdom en el suelo, alrededor de las raíces o en la rizosfera (el área que rodea directamente e incluye la superficie de la raíz) pueden estar afectando a PGPB actividad⁴.

La colonización rizosfera por PGPB puede aumentar la salud o el desarrollo de las plantas anfitrionas en respuesta a diversos factores estresantes en relación con las plantas no colonizadas⁵. Sin embargo, los resultados son a menudo más variables en las condiciones del suelo nativo en comparación con los observados en los invernaderos y entornos de laboratorio estrechamente controlados⁶. Una hipótesis para esta diferencia es que el crecimiento o comportamiento de PGPB puede ser inhibido por bacterias o hongos de suelo nativo en los campos^7,8. Los efectos beneficiosos de las bacterias rizosfera generalmente dependen de la capacidad de las bacterias a 1) localizar y moverse hacia la raíz, 2) colonizar la raíz a través de la formación de biopelículas, y 3) interactuar con la planta huésped o patógenos a través de la producción de moléculas pequeñas metabolitos^7,9. Cualquiera de estos comportamientos de colonización puede verse afectado por la presencia y actividad de los microbios vecinos¹⁰.

Diseñamos un sistema para cuantificar y visualizar estas distintasetapas de colonización bacteriana de la rizoesfera (Figura 1). Este enfoque facilitará los estudios que investigan por qué a veces no se observa el mantenimiento a largo plazo de la PGPB después de la transferencia de plantas a nuevos ambientes, como durante la plantación de plántulas preinoculadas. Arabidopsis thaliana como fueron elegidos como modelo de planta debido a su amplio uso en estudios de laboratorio, así como a los amplios datos disponibles sobre sus interacciones microbianas^11. Hay tres etapas en el sistema: 1) A. crecimiento thaliana, 2) colonización bacteriana, y 3) mantenimiento bacteriano (ver Figura 1). Debido a que A. thaliana es una planta terrestre, era importante asegurarse de que no estaba sufriendo estrés hídrico indebido en el sistema hidropónico^12. Inspirados en los métodos utilizados por Haney et al.¹³, las plántulas se cultivan en malla de plástico para separar el brote del medio de crecimiento líquido. Este sistema no parece comprometer la salud y el desarrollo del huésped de la planta, y mejora el crecimiento de A. thaliana en líquido^11. A medida que el brote de la planta flota sobre la superficie, las raíces están completamente expuestas a la colonización por bacterias inoculadas en el medio de crecimiento bacteriano líquido. Esto permite que las bacterias de interés sean examinadas para la colonización de nutrientes que son más propicios para el crecimiento, mientras que luego cambia las condiciones para permitir que la planta continúe creciendo en un medio nutritivo diseñado para apoyar su crecimiento. Ambas etapas incluyen temblores constantes para prevenir la anoxia de la raíz¹³. Las bacterias se pueden visualizar o cuantificar desde las raíces de la planta después de la transferencia desde el medio de colonización o el medio de mantenimiento. Este sistema hidropónico es muy flexible, permitiendo que las condiciones experimentales y las tensiones aplicadas se alteren fácilmente dependiendo de los intereses de los investigadores.

Este método descrito es importante en el contexto del cuerpo más amplio de literatura sobre las interacciones entre la planta y los microbios, ya que proporciona un sistema robusto para estudiar estas interacciones en la superficie de la raíz, al mismo tiempo que es personalizable a las preferencias de crecimiento de diferentes bacterias. Los laboratorios de biología vegetal a menudo realizan experimentos de colonización de microbios vegetales en agar sólido, lo que permite sólo el movimiento plano (si eso) de bacterias, al tiempo que requiere la manipulación potencialmente destructiva de las plantas durante la transferencia posterior. Por el contrario, los laboratorios de microbiología han priorizado con frecuencia la salud de las bacterias dentro de sus experimentos, en detrimento de las plantas^14,15. Estas diferentes prioridades de los laboratorios centrados en plantas y microbiología han hecho históricamente difícil comparar resultados entre estos grupos, ya que cada uno suele optimizar las condiciones experimentales para optimizar su organismo de interés^15. El sistema de crecimiento de plantas de malla flotante descrito aquí previene la inmersión completa de la planta, una ventaja notable para estudios anteriores orientados a la microbiología, al tiempo que optimiza temporalmente el crecimiento y la supervivencia de las bacterias para facilitar la colonización. Por lo tanto, el ensayo que presentamos aquí puede abordar las preocupaciones de ambos biólogos de plantas (sobre la sobrehidratación y la manipulación táctil de la planta) al tiempo que satisface los criterios de los microbiólogos (permitiendo diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y múltiples interacciones de especies)⁷. Este protocolo está diseñado para ser adaptable para su uso con diversas bacterias, plantas y condiciones ambientales.