رصد الاستعمار البكتيري والصيانة على جذور الثاليانية العربية في نظام مائي عائم
Summary
هنا نقوم بوصف اختبار نمو النباتات المائية لتحديد وجود الأنواع وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا أثناء الاستعمار الأولي لجذور النباتات وبعد نقلها إلى بيئات نمو مختلفة.
Abstract
تشكل البكتيريا ميكروبيومات جذمور معقدة على شكل ميكروبات متفاعلة، وكائنات أكبر، والبيئة اللاأحيائية. في ظل الظروف المختبرية، يمكن أن يزيد استعمار الجذوسفير من قبل البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB) من صحة أو تطوير النباتات المضيفة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة. ومع ذلك، في البيئات الميدانية، غالباً ما لا توفر العلاجات البكتيرية مع PGPB فوائد كبيرة للمحاصيل. أحد التفسيرات هو أن هذا قد يكون بسبب فقدان PGPB أثناء التفاعلات مع الميكروبات التربة الذاتية على مدى عمر النبات. وكان من الصعب تأكيد هذه الإمكانية، لأن معظم الدراسات تركز على الاستعمار الأولي بدلا ً من الإبقاء على PGPB داخل مجتمعات الجذمور. ومن المفترض هنا أن التجمع والتعايش والحفاظ على المجتمعات البكتيرية تتشكل من خلال السمات الحتمية للبيئة الدقيقة الجذمورفيس، وأن هذه التفاعلات قد تؤثر على بقاء PGPB في البيئات الأصلية. لدراسة هذه السلوكيات، يتم تحسين اختبار نمو النبات المائي باستخدام أرابيدوبسي ثاليانا لتحديد وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا خلال الاستعمار الأولي لجذور النبات وبعد الانتقال إلى نمو مختلف البيئات. ثم يتم التحقق من إمكانية استنساخ هذا النظام وفائدته مع PGPB Pseudomonas simiaeالمدروسة جيدا . للتحقيق في كيفية وجود أنواع بكتيرية متعددة قد تؤثر على الاستعمار وديناميات الصيانة على جذر النبات، مجتمع نموذجي من ثلاث سلالات بكتيرية (Arthrobacter، Curtobacterium،وMicrobacterium الأنواع) معزولة أصلا من تم بناء الجذمورفيس الثاليا. ويتضح أن وجود هذه الأنواع البكتيرية المتنوعة يمكن قياسه باستخدام هذا الفحص المائي للنباتات والتيار اللاين، الذي يوفر بديلا ً للدراسات المجتمعية البكتيرية القائمة على التسلسل. قد تحسن الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذا النظام فهم السلوك البكتيري في الميكروبيوم النباتية متعددة الأنواع مع مرور الوقت وفي الظروف البيئية المتغيرة.
Introduction
تدمير المحاصيل من الأمراض البكتيرية والفطرية يؤدي إلى انخفاض إنتاج الأغذية ويمكن أن تعطل بشدة الاستقرار العالمي1. استنادا ً إلى اكتشاف أن الميكروبات في التربة المثبطة هي المسؤولة عن زيادة صحة النبات2،سأل العلماء ما إذا كان يمكن الاستفادة من ميكروبيوم النبات لدعم نمو النبات عن طريق تعديل وجود ووفرة خاصة [ترجم للعربية ] البكتيريا التي تم العثور عليها للمساعدة في نمو النبات أو التنمية تسمى مجتمعة البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB). وفي الآونة الأخيرة، تحولت الدراسات من مجرد تحديد PGPB المحتملة إلى فهم كيف أن التفاعلات بين الممالك في التربة، حول الجذور، أو في الغلاف الجذي (المنطقة المحيطة مباشرة بما في ذلك سطح الجذر) قد تؤثر على PGPB النشاط4.
يمكن للاستعمار Rhizosphere من قبل PGPB زيادة الصحة أو تطوير النباتات المضيفة استجابة لعوامل الإجهاد المتنوعة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة5. ومع ذلك، غالباً ما تكون النتائج أكثر تغيراً في ظروف التربة الأصلية مقارنة بتلك التي لوحظت في الدفيئة والمختبرات التي يتم التحكم فيها عن كثب6. فرضية واحدة لهذا الاختلاف هو أن نمو أو سلوك PGPB قد تكون تمنعها بكتيريا التربة الأصلية أو الفطريات في الحقول7،8. الآثار المفيدة من قبل بكتيريا جذمور تعتمد عموما على قدرة البكتيريا إلى 1) تحديد موقع والتحرك نحو الجذر، 2) استعمار الجذر من خلال تشكيل biofilm، و 3) التفاعل مع النبات المضيف أو مسببات الأمراض عن طريق إنتاج جزيء صغير الأيض7،9. أي من هذه السلوكيات الاستعمارية قد تتأثر بوجود ونشاط الميكروبات المجاورة10.
قمنا بتصميم نظام لتحديد وتصور هذه المراحل الاستعمارية البكتيرية المتميزة من الجذمورسفير (الشكل1). ومن شأن هذا النهج أن ييسر الدراسات التي تحقق في سبب عدم ملاحظة صيانة الـ PGPB الطويلة الأجل في بعض الأحيان بعد نقل النباتات إلى بيئات جديدة، مثل زراعة الشتلات قبل التلقيح. تم اختيار أرابيدوبسي ثاليانا كنموذج نباتي نظراً لاستخدامه الواسع في الدراسات المختبرية وكذلك البيانات الوافرة المتاحة عن تفاعلاته الميكروبية11. هناك ثلاث مراحل في النظام: 1) A. تاليانا النمو، 2) الاستعمار البكتيري، و 3) الصيانة البكتيرية (انظر الشكل1). لأن A. thaliana هو نبات أرضي، كان من المهم التأكد من أنه لا يعاني من الإجهاد المائي لا مبرر له في النظام المائي12. مستوحاة من الأساليب المستخدمة من قبل هاني وآخرون13، وتزرع الشتلات على شبكة بلاستيكية لفصل تبادل لاطلاق النار من وسط النمو السائل. هذا النظام لا يبدو أن المساس بصحة وتطوير المضيف النبات، وأنه يحسن A. تاليانا النمو في السائل11. كما يطفو تبادل لاطلاق النار النبات فوق السطح، تتعرض الجذور تماما للاستعمار من قبل البكتيريا تلقيح في وسط النمو البكتيري السائل. وهذا يسمح للبكتيريا ذات الأهمية لفحصها للاستعمار في المواد الغذائية التي هي الأكثر ملاءمة للنمو، في حين تحول الظروف للسماح للنبات لمواصلة النمو في وسط المغذيات المصممة لدعم نموها. وتشمل كلتا المرحلتين الهز المستمر لمنع أنوكسيا من الجذر13. يمكن تصور البكتيريا أو قياسها كميامن جذور النبات بعد نقلها إما من وسط الاستعمار أو من وسط الصيانة. هذا النظام المائي مرنة جدا، مما يسمح الظروف التجريبية والضغوط المطبقة ليتم تغييرها بسهولة اعتمادا على مصالح الباحثين.
هذه الطريقة الموصوفة مهمة في سياق مجموعة أكبر من المؤلفات حول التفاعلات النباتية والميكروب لأنه يوفر نظام قوي لدراسة هذه التفاعلات على سطح الجذر في حين يجري أيضا للتخصيص لتفضيلات النمو من بكتيريا مختلفة. مختبرات البيولوجيا النباتية في كثير من الأحيان إجراء تجارب الاستعمار النباتات الميكروب على أجار الصلبة، مما يسمح لحركة المسطحة فقط (إذا كان ذلك) من البكتيريا في حين تتطلب أيضا التلاعب المدمرة المحتملة للنباتات خلال النقل اللاحقة. وعلى النقيض من ذلك، فإن مختبرات علم الأحياء الدقيقة أعطت الأولوية في كثير من الأحيان لصحة البكتيريا ضمن تجاربها، على حساب النباتات14،15. هذه الأولويات المختلفة للمختبرات التي تركز على النبات والميكروبيولوجيا جعلت تاريخيا من الصعب مقارنة النتائج بين هذه المجموعات، لأن كل عادة ما يحسن الظروف التجريبية لتحسين الكائن الحي من الفائدة15. نظام النمو النباتي العائم الشبكي الموصوف هنا يمنع الغمر النباتي الكامل، وهو ميزة ملحوظة للدراسات السابقة الموجهة نحو علم الأحياء الدقيقة، مع تحسين نمو البكتيريا وبقائها بشكل مؤقت لتسهيل الاستعمار. وهكذا، فإن التقييم الذي نعرضها هنا قد يعالج المخاوف من كل من علماء الأحياء النباتية (حول الإفراط في الترطيب والتلاعب عن طريق اللمس من النبات) مع تلبية معايير علماء الأحياء الدقيقة (السماح لظروف النمو البكتيرية المختلفة ومتعددة التفاعلات الأنواع)7. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون قابلاً للتكيف مع مختلف البكتيريا والنباتات والظروف البيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
النباتات في جميع البيئات تتفاعل مع الآلاف إلى الملايين من البكتيريا المختلفة والفطريات5،7. ويمكن لهذه التفاعلات أن تؤثر سلبا وإيجابا على صحة النبات، مع ما قد يترتب على ذلك من آثار على غلة المحاصيل وإنتاج الأغذية. ويشير العمل الأخير أيضاً إلى أن الاستعمار ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال صناديق البحوث التي قدمتها وزارة الطاقة للبحوث البيولوجية والبيئية (DOE-BER 0000217519 إلى E.A.S.)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S). كما تلقى البرنامج الدعم من برنامج زمالات بحوث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم. نشكر الدكتور جيفري دانغل على توفير سلالات بكتيرية وبصيرة لا تقدر بثمن. نشكر الدكتور أندرو كلاين وماثيو ج. باورز على الاقتراحات التجريبية. وأخيراً، تود SLH أن تشكر الاتصالات على وسائل التواصل الاجتماعي لتذكيرنا بأن نشر العلم هو امتياز ومسؤولية، لا سيما من خلال وسائل خلاقة وسهلة المنال.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
