JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث المعوية المشتقة لدراسة وتعديل الحماية الخلوية الظهاريه ضد السالمونيلا ومسببات الامراض الأخرى

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/59478
, , , , ,
1Wellcome Trust Sanger Institute, 2Department of Medicine,University of Cambridge, 3University of Cardiff

Summary

الإنسان المستحثة مستحث الخلايا الجذعية (hiPSC)-المشتقات المعوية المستمدة توفر فرصا مثيره لنمذجة الامراض المعوية في المختبر. ونحن نظهر التمايز من hiPSCs في العضوية المعوية (iHOs) ، وتحفيز هذه iHOs مع السايتوكينات ، والحقن المجهري من السالمونيلا التيفوئيد في التجويف الهيدروغرافي ، مما يتيح دراسة الغزو الظهاريه من قبل هذا الممرض.

Abstract

المعوية ‘ organoid ‘ (الهيدروغرافي) النظام ، حيث الهياكل ثلاثية الابعاد ممثل البطانة الظهاريه من الأمعاء البشرية يمكن ان تنتج من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (hiPSCs) والحفاظ عليها في الثقافة ، ويوفر فرصه مثيره لتسهيل نمذجة الاستجابة الظهاريه للعدوى المعوية. في الجسم الحيوي, الخلايا الظهاريه المعوية (IECs) تلعب دورا رئيسيا في تنظيم التوازن المعوي وقد تمنع مباشره مسببات الامراض, علي الرغم من ان أليات التي يحدث هذا لا توضح تماما. وقد تبين ان السايتوكيني interleukin-22 (آيل-22) تلعب دورا في صيانة والدفاع عن الحاجز الظهاريه الأمعاء ، بما في ذلك حمل الإفراج عن الببتيدات المضادة للميكروبات و مستقطبات ردا علي العدوى.

ونحن وصف التفريق بين السيطرة الصحية hiPSCs في iHOs عن طريق أضافه مجموعات خلوية محدده إلى ثقافتهم المتوسطة قبل تضمينها في الطابق السفلي غشاء المبنية علي أساس مصفوفة نظام الثقافة المعوية. مره واحده مدمجه, وتزرع iHOs في وسائل الاعلام تستكمل مع نوجين, R-سبوندين-1, عامل نمو البشرة (EGF), CHIR99021, بروستاغلاندين E2, و 27632 ثنائي هيدروكلوريد مونوهيدرات. وتؤدي المقاطع الاسبوعيه من خلال التعطيل اليدوي للهيكل التنظيمي للمنظمة الهيدروغرافية الخاصة إلى تشكيل النظام الرئيسي الذي يضم بعض الهياكل المبنية علي السرداب/الزغب. جميع iHOs تظهر ظهاره متمايزة تتكون من الخلايا القدح ، والخلايا الغدد الصماء ، والخلايا Paneth ، والأمعاء المستقطبة ، والتي يمكن تاكيدها عن طريق المناعي لعلامات محدده من كل مجموعه فرعيه الخلية ، ونقل المجهر الكترون (TEM) ، والكمية PCR (qPCR). لنموذج العدوى ، السالمونيلا معوي سيرفار التيفوئيد SL1344 هي ميكروحقن في تجويف ihos وحضنت لمده 90 دقيقه في 37 درجه مئوية ، ويتم اجراء فحص الحماية جنتاميسين تعديل لتحديد مستويات داخل الخلايا الغزو البكتيري. يتم التعامل مع بعض iHOs أيضا مع الإنسان المؤتلف IL-22 (rhIL-22) قبل العدوى لتحديد ما إذا كان هذا السايسيسين واقيه ضد عدوي السالمونيلا .

Introduction

في السنوات الاخيره ، تم تعزيز دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض من خلال تطوير نماذج “organoid” ، حيث يمكن إنتاج التمثيلات ثلاثية الابعاد لظهاره الأمعاء من المقدمين المختلفين. ويمكن توليد “الاوليه” العضوية مباشره من الخلايا الجذعية المعوية التي تحصد من الخزعات المعوية. الاضافه إلى ذلك ، يمكن توليد الأرغن المعوية من hiPSCs. ويمكن ان يقال نفسه من العديد من الانسجه ، مع المعدة1، الكبد2، البنكرياس3،4، الدماغ5،6، الرئة7، والبروستاتا8 organoids المستخدمة من قبل العديد من الباحثين لنموذج المرض. هناك العديد من التطبيقات المثيرة للنظام organoid ، بما في ذلك النمذجة السرطان9 وفحص المخدرات10، ولكن هنا نركز علي استخدام ihos كنموذج العدوى ، وذلك باستخدام S. [ انتركا ] [سرفار] [تيموريوم] ([س.]. التيفوئيد) كممرض مثالي والمعالجة المسبقة مع IL-22 كعلاج.

وفي هذه الدراسة ، فان الهياس المستخدمة لتوليد الهيدروغرافية هي “Kolf2” iPSCs ، المتولدة من فرد سليم ومتاحه من اتحاد مبادرة الخلايا الجذعية مستحث البشرية (Hipscs ؛ www.hipsci.org) ، وهي لوحه مرجعيه مفتوحة الوصول تتميز خطوط hiPSC11. ميزه واحده من استخدام hiPSCs كمقدمي لل organoids هو ان هناك الآن بنوك واسعه من خطوط iPSC المانحين الصحية المتاحة ، وهذا يعني انه يمكن التحقق من صحة النتائج في عدد من خطوط الخلايا مع خلفيات وراثيه مختلفه. الاضافه إلى ذلك ، إذا كان الباحثون يرغبون في النظر في الاشكال المحددة المرتبطة بالمرض واحده الاشكال النيوكليوتيد (SNPs) ، فمن الممكن استخدام CRISPR/كاس 9 لهندسه الطفرات في خط خليه صحية ، التالي إنتاج كل من خط متحولة والحفاظ علي ايزوتون خط التحكم للمقارنة12. في تجربتنا ، والعضوية المعوية المشتقة hiPSC هي أكبر في الحجم من نظرائهم الاساسيه وأكثر اتساقا في الثقافة ، مما يجعل لأقل الحقن المجهرية الصعبة من الناحية الفنية ويحتمل ان تسمح مجموعه أكثر تنوعا من مسببات الامراض لتكون درس. ويمكن الديتريوم الحفاظ علي النظام الكتروني للمنظمة ، وقد نشرنا ثقافات المعهد الهيدروغرافي الكتروني لمده تصل إلى سنه لإنتاج مواد لتجريبها.

في الجسم الحيوي, IECs تلعب دورا رئيسيا في تنظيم التوازن المعوي وقد تمنع مباشره مسببات الامراض, علي الرغم من ان أليات التي يحدث هذا لا يفهم جيدا. ومن المعروف ان سيتوكين آيل-22 ان يكون لها دور في الحفاظ علي الحاجز الظهاريه الأمعاء13 وتشارك في الحث وإفراز الببتيدات المضادة للميكروبات و مستقطبات استجابه للعدوى14. يتم إنتاجه من قبل خلايا T المنشطة (وخاصه ، خلايا Th17) وكذلك من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ويربط إلى مستقبلات هيتيروديميريك تتالف من IL-22R1 و IL-10R2 الوحدات الفرعية15. عبرت المستقبل ل [آيل-22] [بسلي] علي [اياكس], يعني ان في ال [أو] نموذج, هو يمكن ان [بريوسنويد] ال [ارغنويدس] مع [رهيل-22] ببساطه بإضافته إلى ثقافة متوسطه16. عيب واحد من النظام العضوي هو انه يفتقر إلى الاستجابة المناعية المرتبطة التي يتم تسليمها عاده من قبل أنواع الخلايا المناعية الأخرى. ومع ذلك, النماذج الناشئة التي تحاول الزراعة العضوية العضوية مع الخلايا الليمفاوية المعوية لتمثيل أفضل هذا17,18.

ان استخدام نظام الحقن المجهري هو المفتاح لمحاكاة العدوى في نموذج الشبكة الهيدروغرافية الكترونيه ، لان هذا يسمح بالتسليم المباشر لمسببات الامراض إلى السطح الابيكي لظهاره ، كما يحدث في حاله العدوى المجرية. وأضافه الفينول الأحمر إلى المحلول البكتيري الذي يحقن في الهيدروغرافية المذكورة هي التي أصيبت بالعدوى ، التالي تجنب الحقن المتكرر لنفس الهيدروغرافية. Organoids كما السفن لنمذجة العدوى تنمو في الاستخدام ، مع مسببات الامراض مثل الملوية بيلوري،19 نوروفيروس ،20 الروتا ،21 شيغا-المنتجة للسموم القولونية 22، وقد ثبت ان الشبكة العنكبوتية23، وفيروس زيكا24 ، علي قيد الحياة وتتكرر داخل هذه النظم. ويمكن تطبيق هذه التكنولوجيا علي نطاق أوسع من مسببات الامراض ، ولا سيما الكائنات الحية التي يصعب استزراعها ، مثل البروتوزوا ، أو مسببات الامراض المقيدة بالإنسان ، من أجل الحصول علي معلومات مباشره عن الاستجابة الظهاريه البشرية للعدوى.

Protocol

1. الخياطة والمرور من الخلايا الجذعية مستحث المستحثة ملاحظه: تستخدم جميع الطرق الموصوفة هنا خطوط الخلايا البشرية المتاحة تجاريا. وينبغي ان يتم جميع العمل ثقافة النسيج المفصل أدناه في الطبقة الثانية غطاء للتدفق. يتم الاحتفاظ iPSCs بشكل روتيني في ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، والذي يسمح للثقافة الحرة في عطله نهاية الأسبوع من ipscs. يمكن تكييف iPSCs من أنظمه الثقافة Ipscs الأخرى بسهوله نسبيه. مرور الخلايا مره واحده في المستعمرات تغطي ما يقرب من 80 ٪-90 ٪ من سطح اللوحة. اعداد لوحات للمرور 1 ح قبل الاستخدام عن طريق أضافه vitronectin 10 ميكروغرام/مل المخفف في المحلول الملحي الفوسفات المخزنة في دولبيكو (DPBS ؛ بدون الكالسيوم [Ca] أو المغنيسيوم [مغ]) إلى لوحات الانسجه المعالجة الثقافة. وحدات التخزين للطلاء تعتمد علي حجم لوحه ويمكن العثور عليها في تعليمات الشركة المصنعة. خلال هذا الوقت ، الدافئة ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة إلى درجه حرارة الغرفة (RT). أزاله الوسائط من iPSCs جاهزه للمرور وغسل الخلايا 2x مع DPBS (بدون Ca أو Mg). أضافه حل أدتا (انظر جدول المواد) إلى لوحات ، والتاكد من السطح بأكمله هو المغلفة واحتضان في RT لمده 5-8 دقيقه. عندما تبدا الثقوب لتظهر في وسط مستعمرات iPSC ، يستنشق والتخلص من الحل أدتا. أضافه ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة إلى الآبار. أزاحه iPSCs عن طريق غسل بلطف وسائل الاعلام علي سطح لوحه عده مرات. يتم تمرير iPSCs ككتل وليس كخلايا واحده ، لذلك تاكد من ان الحل أدتا لم يبق علي لفتره طويلة جدا. نقل اي iPSCs طرد إلى أنبوب مخروطي 15 مل. يستنشق vitronectin من لوحات بريكواتد واستبدالها مع ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة. عكس تعليق iPSC عدد من المرات للتاكد من Ipsc لم تستقر في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي ، وأضافه الحجم المناسب من تعليق لإعطاء 1:10 التخفيف من الخلايا علي لوحه جديده. يمكن تعديل نسب الانقسام تبعا لمعدل نمو iPSC ، والذي قد يختلف بين خطوط iPSC. صخره لوحه لتفريق iPSCs علي السطح ووضعه في حاضنه في 37 درجه مئوية/5 ٪ CO2. إطعام iPSCs في اليوم بعد المرور. 2. التمايز من iPSCs إلى هندغوت في يوم 0، وتقسيم ipscs علي 10 سم الانسجه الثقافة المعالجة الطبق ، بريكواتد مع vitronectin كما هو موضح في الخطوة 1.2 ، إلى 10 مل من الخلايا الجذعية ثقافة المتوسطة تستكمل مع activin a (10 نانوغرام/مل) + عامل النمو الليفي الاساسيه (bfgf ؛ 12 نانوغرام/مل). أضافه عوامل النمو إلى وسائل الاعلام مباشره قبل الاستخدام ؛ القيام بذلك في جميع الخطوات اللاحقة. في اليوم 1، تغيير وسائل الاعلام (10 مل من الخلايا الجذعية الثقافة المتوسطة مع activin [10 نانوغرام/مل] + bFGF [12 نانوغرام/مل]). في اليوم 2، تبدا التمايز عن طريق تغيير وسائل الاعلام إلى 10 مل من ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة تستكمل مع عوامل النمو التالية: activin A (100 ng/ml) ، bfgf (100 ng/ml) ، العظام البروتين مورفوجينيتيك 4 (BMP-4 ؛ 10 نانوغرام/مل) ، الفوسفاواينوزيتول 3- كيناز مثبط LY294002 (10 μM) ، ومثبط GSK3 CHIR99021 (3 μM). في اليوم 3، تغيير وسائل الاعلام إلى 10 مل من ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة تستكمل مع Activin A (100 Ng/ml) ، bFGF (100 Ng/ml) ، BMP-4 (10 نانوغرام/مل) ، و LY294002 (10 μM). وينبغي ان تؤدي مواصفات اندوديرم المستحثة بواسطة هذه الوسائط إلى تغييرات مرئية لتشكل مستعمره iPSC علي مدار ال 24 ساعة التالية. في اليوم 4، تغيير وسائل الاعلام إلى 10 مل من Rpmi/B27 وسائل الاعلام تستكمل مع Activin A (100 Ng/ml) و bFGF (100 Ng/ml).ملاحظه: RPMI/B27 وسائل الاعلام يحتوي 500 مل من المتوسط RPMI مع الملحق L-الجلوتامين (انظر الجدول 1) ، 10 مل من B27 الملحق (50x ، المصل الحرة) ، و 5 مل من الأحماض الامينيه غير الاساسيه. اختياري: أضافه 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/mL). تصفيه تعقيم قبل الاستخدام. في اليوم 5، تغيير وسائل الاعلام إلى 10 مل من rpmi/ب-27 وسائل الاعلام تستكمل مع Activin A (50 Ng/mL). في اليوم 6، للبدء في زخرفه الأديم الخلفي إلى الأمعاء ، تغيير وسائل الاعلام إلى 10 مل من وسائل الاعلام rpmi/B27 تستكمل مع CHIR99021 (6 μm) + حمض الريتينويك (3 μm). في الأيام 7و 8و 9، كرر الخطوة 2.7. خلال هذه الخطوات ، يجب ان تصبح الهياكل ثلاثية الابعاد المرئية من الأمعاء الدقيقة واضحة ، وتغطي سطح الصفيحة. في اليوم 10، وتضمين الأمعاء الناتجة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد). 3. دمج من هندغوت في مصفوفة غشاء الطابق السفلي تشكل وسائل الاعلام النمو قاعده الهيدروغرافي (500 mL من المتقدمة دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة [DMEM]/f12 ، 10 مل من الملحق B27 [50x, مصل الحرة], 5 مل من الملحق N2 [100x, مصل الحرة], 5 مل من 1 م 4-(2-هيدروكسي ايثيل) -1-حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (HEPES), و 5 مل من الأحماض الامينيه غير الاساسيه [100x]. اختياري: أضافه 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين [10,000 U/mL] ؛ تصفيه تعقيم قبل الاستخدام. انظر الجدول 1). أزاله وسائل الاعلام من لوحه المؤخر ، وغسل لوحه 1x مع DPBS (بدون Ca أو Mg). أضافه 5 مل من محلول كولاجيناز إلى لوحه واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق. إنتاج محلول كولاجيناز عن طريق أضافه 500 ملغ من مسحوق الرابع كولاجيناز إلى 400 مل من DMEM المتقدمة/F12. بعد ذلك ، أضافه 100 mL من استبدال المصل (انظر جدول المواد) ، 5 مل من L-الجلوتامين (200 mM) ، و 3.5 μl من 2-mercaptoethanol ، ودوامه الحل لخلط. فلتر-تعقيم المحلول بمجرد ذوبان مسحوق كولاجيناز تماما.ملاحظه: ويمكن تخزين هذا في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أشهر في الارصفه الصغيرة. Inactivate كولاجيناز عن طريق أضافه 5 مل من وسائل الاعلام الشبكة الهيدروغرافية النمو قاعده إلى لوحه وكشط الخلايا الخلفية باستخدام مكشطه الخلية ، وجمع تعليق الأمعاء في أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 240 x g ل 1 دقيقه وماصه قباله supernatant. أضافه 10 مل من وسائل الاعلام ، وتفريق المؤخر إلى قطع أصغر بواسطة الأنابيب بلطف ، والطرد المركزي مره أخرى في 95 x g ل 1 دقيقه. اغسل الخلايا 2x في وسائط الشبكة الهيدروغرافية الخاصة بالنمو الأساسي عن طريق تكرار الخطوة 3.5. أعاده تعليق الخلايا في حجم صغير من متوسط نمو قاعده (~ 300-500 μL) وأضافه حوالي 100 μL من هذا الحل إلى 1.5 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. يجب ان تبقي مصفوفة علي الجليد خلال هذا الوقت لأنها سوف تبدا في ترسيخ بسرعة في RT. اعداد لوحه 24 بئر علي سخان لوحه في 37 درجه مئوية وبقعه من 60 μL في بئر واحده من لوحه 24 بئر. السماح لها لتعيين لفتره وجيزة والتحقق من كثافة تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، أضافه المزيد من الحل هندغوت إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي في زيادات حتى يتم تحقيق التركيز المطلوب ، وبقعه من الحل في الآبار المتبقية. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ؛ ثم ، أضافه 800 μL من وسائل الاعلام النمو قاعده الشبكة الهيدروغرافية التي تحتوي علي عوامل النمو لكل بئر من 24-بئر لوحه في التركيزات التالية (انظر الجدول 1): 500 Ng/ml R-سبوندين-1 ، 100 Ng/ml نوجين ، 100 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (egf) ، 3 μm CHIR99021 ، 2.5 μm بروستازيبين E2 ، و 10 μM Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد مونوهيدرات (المانع روك). قم بتغيير وسائط النمو الاساسيه للمنظمة كل يومين أو ثلاثه أيام ، أو فورا إذا بدات الوسائط في التغير. بعد البذر الاولي في مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، والسماح iHOs لتطوير لمده 7 أيام قبل تقسيمها. في اليوم 3 – 4 ، يجب ان تكون المجالات المتميزة مرئية في الثقافة. لتغيير وسائل الاعلام وحده ، حذف Y-27632 ، لان هذا مطلوب فقط عند تقسيم/البذر. 4. صيانة ومرور iHOs للسماح بالذوبان التدريجي ، ضع الحجم المطلوب من مصفوفة غشاء القبو في دلو جليدي مغطي عند 4 درجات مئوية بين عشيه وضحيها ، 24 ساعة قبل التقسيم. أزاله وسائل الاعلام من iHOs واستبدالها مع 500 μL من حل رفع الخلية (انظر جدول المواد) لكل بئر. احتضان في 4 درجه مئوية ل 40-50 دقيقه ، وعند هذه النقطة يجب ان تكون عائمه iHOs في الحل. اختياري: استخدام نظام التصوير في هود لتحديد iHOs فقط مع الشكل المطلوب (انظر جدول المواد). ماصه برفق الهيدروغرافي/خليه رفع الحل تعليق في أنابيب مخروطيه 15 مل ، في محاولة لعدم تفريق iHOs. السماح IHOs لتسويه لمده 3 – 5 دقيقه وأزاله الخلايا الفائقة والوحيدة. أعاده تعليق iHOs في 5 مل من متوسط نمو قاعده الهيدروغرافي الكتروني وماصه لهم بلطف لغسل. الطرد المركزي في 95 x g لمده 2 دقيقه. اعداد لوحه 24 بئر علي سخان لوحه في 37 درجه مئوية داخل غطاء محرك السيارت. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق ihos في ~ 300-500 μl من وسائل الاعلام نمو القاعدة ، وذلك باستخدام ماصه P1000 لتفريق ihos إلى قطع أصغر. وتجدر الاشاره إلى ان القوه التي يجب تطبيقها ستختلف باختلاف الخط الهيدروغرافي وحاله النضج ، التالي تبدا بلطف وتزيد القوه إذا لزم الأمر. مكان ~ 100 μL من iHOs (حجم يعتمد علي كثافة الحل) في 1.5 mL من مصفوفة غشاء الطابق السفلي وماصه لفتره وجيزة لخلط. بقعه من 1 × 60 μL من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر واحده من لوحه 24 بئر ، وترك الأمر ليصلب ~ 30 s ، ومن ثم تحقق من كثافة تحت المجهر. إذا كانت الكثافة منخفضه جدا ، قم باضافه المزيد من iHOs إلى المصفوفة. كرر الخطوة 4.8 حتى يتم الحصول علي كثافة الصحيح ، ومن ثم بقعه خارج بقية المصفوفة إلى لوحه 24 بئر. وضعه في حاضنه في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، ثم ، تراكب مع 800 μL من متوسط نمو قاعده مع عوامل النمو ، كما هو موضح في الخطوة 3.7. لاعداد iHOs لتجربه اختبار الغزو (المبينة أدناه) ، ومرور iHOs 4-5 أيام قبل التجربة كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.10 ، ولكن وضع 120 μL من الحل الهيدروغرافي مصفوفة المتولدة في الخطوة 4.7 إلى 5 ملم الزجاج القاع الحقن المجهرية الاطباق. بدلا من ترك تعليق النظام الهيدروغرافي الخاص في قطره كما هو الشان مع المرور الروتيني ، ونشر قطره علي الجزء السفلي من الطبق لخلق طبقه رقيقه من المصفوفة. تغطيه مع 2.5 mL من متوسط نمو قاعده بالاضافه إلى عوامل النمو.ملاحظه: إذا تم استخدام المضادات الحيوية في الثقافة المتوسطة ، يجب أزاله هذه واستبدالها مع وسائل الاعلام غير المضادات الحيوية لتجارب الحقن المجهري. 5. المسبق من iHOs مع rhIL-22 يستنشق وسائل الاعلام من iHOs واستبدالها مع وسائل الاعلام نمو قاعده جديده (والتي يجب ان لا تحتوي علي المضادات الحيوية) 18 ح قبل الفحص الغزو. أضافه rhIL-22 إلى وسائل الاعلام الثقافة إلى التركيز النهائي من 100 ng/mL. 6. الحقن المجهري من iHOs واختبارات الغزو داخل الخلايا في اليوم السابق للتجربة ، قم باعداد S. SL1344 ثقافة التيفوئيد في 10 مل من مرق لوريا-بيرتاني واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها مع الاهتزاز. في يوم التجربة ، إذا كان المجهر مع غرفه الحرارة المغلقة متاح ، تشغيله والسماح لدرجه الحرارة للوصول إلى 37 درجه مئوية قبل بدء الفحص. تمييع الثقافات البكتيرية بين عشيه وضحيها في DPBS (التي تحتوي علي Ca و Mg) إلى كثافة بصريه من 2 في 600 nm (OD600) ، ثم مزجها 1:1 مع الفينول الأحمر. قم بتحميل طبق الحقن المجهري الذي يحتوي علي iHOs علي مرحله المجهر ، وأزاله الغطاء ، وجعل iHOs في بؤره التركيز ، وجاهز للبدء في الحقن. أدر الحاقن ومحطات التحكم بالذراع. تاكد من تعيين حاقن إلى ضغط من 600 كيلو باسكال ووقت الحقن من 0.5 s. إذا لم يتم بالفعل المدعومة بعيدا عن مرحله المجهر ، تدوير ذراع الحقن للتاكد من انها. قم باعداد طرف مثقاب بالحقن المجهري بمقدار 6 ميكرون عن طريق أزاله التفاف والاسطوانه البلاستيكية من الابره. أزاله راس قبضه من الذراع بالحقن. تحميل غيض الحفر مع 10 μL من العجان ، والتي تجتاح غيض الحفر بلطف في نهايته حاده. ضع طرف المثقاب في راس القبضة واعده إلى ذراع الحقن المجهري. حرك الذراع برفق إلى الموضع بحيث تقع الابره 1 – 2 سم فوق طبق الحقن المجهري. استخدام السيطرة علي الذراع لوضع غيض ابره في وسط الطبق وخفضه حتى انه مجرد علي سطح وسائل الاعلام. برنامج الذراع محطه التحكم لأعاده الابره إلى هذه النقطة بعد كل الحقن. التركيز علي المجهر علي iHOs وحدد الهدف لحقن. ضع الابره فوق والي يمين الهيدروغرافية ليتم حقنها وتحريك الابره إلى الأسفل وأفقيا إلى تجويف الهيدروغرافية. اضغط علي زر الحقن علي الحاقن المجهري. الخليط البكتيري الملطخ بالفينول سيخرج من الابره. حقن كل الهيدروغرافي 3x. حقن ما لا يقل عن 30 iHOs لكل حاله.ملاحظه: نظرا للتباين في حجم وهيكل الهيئة الهيدروغرافية التابعة للثقافة ، من الضروري حقن عدد كبير من iHOs للسيطرة علي الاختلاف. عندما يتم حقن جميع iHOs المطلوبة ، وأزاله لوحه الحقن المجهري من المرحلة ، واستبدال الغطاء ، واحتضان لوحه في 37 درجه مئوية لمده 90 دقيقه. بعد 90 دقيقه ، يستنشق وسائل الاعلام النمو واستبدالها مع 3 مل من حل رفع الخلية ؛ احتضان في 4 درجه مئوية ل 45 دقيقه. نقل بلطف الحل iHOs/خليه رفع إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي علي 5 مل من DPBS. تاكد من أزاله جميع iHOs المحقونة من اللوحة (شطف الصفيحة ب1 مل من DPBS إذا لزم الأمر). الطرد المركزي في 370 x g لمده 3 دقائق. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق ihos في قاعده النمو وسائل الاعلام التي تحتوي علي جنتاميسين في 0.1 ملغ/مل (أضافه 1 مل من وسائل الاعلام ؛ ثم ، استخدم ماصه P1000 ~ 50x لتفريق ihos ، وأضافه 4 مل من وسائل الاعلام الأخرى). احتضان في 37 درجه مئوية ل 1 ح لقتل البكتيريا خارج الخلية. الطرد المركزي iHOs في 370 x g لمده 3 دقائق ويستنشق supernatant ، وترك اقل قدر ممكن. غسل iHOs 1x مع DPBS والطرد المركزي مره أخرى.ملاحظه: هذه الخطوة تزيل جنتاميسين ، وهو أمر مهم لان اي جنتاميسين المتبقية قد تقتل البكتيريا داخل الخلايا بمجرد ان يتم التخلص منها. أعاده تعليق iHOs في 500 μL من المخزن المؤقت تحلل (انظر جدول المواد) وفك العضوي يدويا عن طريق التنضيد ~ 50x. اترك هذا الخليط لمده 5 دقائق في RT. يخفف المحلول الناتج 10 اضعاف في DPBS لتوليد تركيزات 10-1، 10-2، و 10-3 . الماصة 3 × 20 μL قطرات من الحلول أنيق والمخفف علي لوحات أجار LB المسخن. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية وأداء مستعمره العد وحساب وحدات تشكيل مستعمره (كفو). وسوف تعكس التهم مستعمره أرقام البكتيريا داخل الخلايا التي تم الإفراج عنها اثناء عمليه ليسينج الخلية. 7. تجميد الخلايا والانتعاش ملاحظه: وكما ذكر سابقا ، فمن الممكن الديتريوم الحفاظ علي iHOs وأعاده تشكيلها عند الرغبة. ويرد أدناه موجز لعمليات التجميد والذوبان. حدد ابار iHOs التي ترغب في تجميدها. أضافه حل رفع الخلية إلى الآبار واحتضان لمده 40-50 دقيقه في 4 درجه مئوية. يجب ان تكون عائمه iHOs في الحل. ماصه برفق iHOs إلى أنبوب مخروطي 15 مل والسماح لهم بالاستقرار. أزاله وسائل الاعلام وغسل iHOs 1x مع وسائل الاعلام النمو الأساسي (اي عوامل النمو). أجهزه الطرد المركزي في 95 x g لمده 2 دقيقه ، وأزاله supernatant ، واستبداله بحجم مناسب من الخلية تجميد المتوسطة (انظر جدول المواد ؛ استخدام المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) ، والتخلص من ihos في قارورة المبردة. تخزين قوارير في 80 درجه مئوية الفريزر بين عشيه وضحيها للسماح بمزيد من التجمد التدريجي. ثم ، نقلها إلى تخزين النيتروجين السائل. لأعاده تشكيل iHOs ، تذويب بسرعة قارورة المبردة في 37 درجه مئوية باستخدام حمام المياه/حبه. ثم ، ماصه بلطف محتوياته إلى 10 مل من وسائل الاعلام نمو قاعده (اي عوامل النمو). السماح iHOs لتسويه واستبدال وسائل الاعلام مع ~ 300 μL من وسائل الاعلام نمو قاعده جديده. لا تقم بفك اقتران iHOs يدويا. أضافه iHOs إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي ولوحه لهم علي النحو المبين في القسم 3.

Representative Results

بعد بدء عمليه التمايز ، يجب ان تمر الخلايا من خلال مرحله تشكيل الأديم الباطن النهائي متبوعا زخرفه المؤخر قبل التضمين في مصفوفة غشاء القبو. خزان سوف تشكل والثقافات مع كميات كبيره من المواد الملوثة سيتم مسح علي مدي فتره من عده أسابيع كما iHOs ناضجه. تظهر الصور التوضيحية لعمليه التمايز والتضمين والمرور في الشكل 1. الاعداد لنظام الحقن المجهري كما هو موضح في الشكل 2. و iHOs هي ميكروحقن مع محلول الفينول الأحمر/البكتيرية والاحتفاظ بلونها الأحمر, السماح للتعرف علي iHOs المصابة لمنع الحقن المكررة. يتم اجراء التهم من البكتيريا داخل الخلايا مطلي بعد فحص الحماية جنتاميسين تعديل; المسبق مع rhIL-22 يقيد S. عدوي التيتيموريريوم ، مع عدد اقل من البكتيريا داخل الخلايا التي لوحظت بعد علاج rhIL-22 (الشكل 3). ونحن أيضا بشكل روتيني معالجه iHOs المصابة للمناعة ، أو TEM ، من أجل تسهيل التصور من التفاعلات المضيفة IEC-البكتيرية (الشكل 4). الشكل 1: التفريق الموجه من iPSCs إلى iHOs. تسلسل تمثيلي من التمايز من iPSCs إلى iHOs ، مما يدل علي التغييرات المورفولوجية التي لوحظت وعوامل النمو اللازمة لدفع هذه التغييرات. يتم تشكيل الأديم الباطن النهائي في اليوم 4 من التمايز ، بعد التعرض لتركيزات محدده من مجموعات من activin A ، FGF ، BMP-4 ، LY294002 ، و CHIR99021. بعد 8 أيام ، وزخرفه من هذا الأديم الباطن نهائي مع تركيزات محدده من CHIR99021 والنتائج حمض الريتينويك في تشكيل هندغوت. التضمين اللاحق ، يتم ملاحظه التشكيل الكروي. بعد المرور المستمر باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي الداعم مضافه مع المتوسطة تستكمل مع عوامل الانتشار المعوية R-سبوندين 1 ، نوجين ، egf ، CHIR99021 ، وبروستاغلاندين E2 ، والتقدم الخزان في ihos التي المبرعمه. (تم التقاط الصور بالتكبير بدقه 4x – 10x). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الحقن المجهري للمنظمة الهيدروغرافية الخاصة مع S. Typhimurium. (ا) نظام الحقن المجهري (انظر جدول المواد) المرفق في الغرفة البيئية ؛ وهذا يسمح للحقن iHOs في بيئة تسيطر عليها (37 درجه مئوية/5 ٪ CO2). (ب) يتم تسليم العين البكتيرية مباشره إلى تجويف الشبكة الهيدروغرافية التابعة باستخدام ميكروشعري ملحق بنظام الحقن المجهري. (ج) من خلال خلط البكتيريا البكتيرية مع الفينول الأحمر ، فمن الواضح التي قد أصيبت ihos ، التالي تجنب الحقن المكررة من نفس المعهد الهيدروغرافي التابع. تم التقاط الصور في التكبير 10x. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: المعالجة المسبقة من iHOs المستمدة من خط الخلية Kolf2 مع rhIL-22 يقيد S. SL1344 في الخلايا الظهاريه المعوية. لاختبارات الحماية جنتاميسين ، تم التعامل مع iHOs مع 100 ng/mL rhIL-22 18 h قبل العدوى ، أو ترك دون علاج ، وحضن لمده 90 دقيقه بعد الاصابه. المعطيات [منس] من ثلاثه [تشنيكل] فنيه ل ثلاثه احيائيه متماثلة ± [سيم]. لاختبار اهميه, وقد استخدمت الاختبارات مان ويتني يو; p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تفاعل IECs مع s. تيموريريوم SL1344. هذه اللوحات تثبت iHOs حقن مع S. SL1344 وحضنت لمده 3 ساعات ، قبل التثبيت والمعالجة ل (ا) المناعي أو (ب) المجهر الكترون الإرسال. في اللوحة A، وينظر البكتيريا داخل التجويف الهيدروغرافي والتفاعل مع ظهاره. وملطخه نوى مع 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) ديلاكتوات (الأزرق) ، اغشيه الخلايا مع phمسبوك (الأحمر) ، والبكتيريا مع CSA-1 (الأخضر). تؤخذ الصور في التكبير 20x. ويبين الفريق باء ثلاثه مسارات مختلفه للمعالجة داخل الخلايا من السالمونيلا بعد الغزو ؛ وينظر إلى البكتيريا (ا) داخل فجوه التي تحتوي علي السالمونيلا، (ب) الحرة داخل السيتوبلاسما ، و (ج) التي تمر بالغيار الذاتية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. RPMI/B27 المتوسطة مكون: المبلغ: RPMI 1640 وسائل الاعلام مع الملحق الجلوتامين 500 مل B27 المصل خاليه 50x الملحق 10 مل متوسط النمو القاعدي للمنظمة مكون: المبلغ: متقدم DMEM/F12 500 مل B27 المصل خاليه 50x الملحق 10 مل مكمل مصل الدم الخالي من N2 100x 5 مل HEPES 1 M 5 مل L-الجلوتامين 200 mM 5 مل عوامل النمو لمتوسط نمو قاعده الهيدروغرافية الخاصة مكون: المبلغ: المؤتلف الإنسان R-spondin1 500 ng/mL المؤتلف الإنسان نوجين 100 ng/mL عامل نمو البشرة (EGF) 100 ng/mL بروستانت 2.5 μM CHIR99021 3 μM Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد مونوهيدرات 10 ميكرومتر الجدول 1: وصفات إعلاميه.

Discussion

يحدد هذا البروتوكول التفريق بين hiPSCs في iHOs وفائدتها كنموذج لمحاكاة التهابات المعوية. وفيما يلي ، نقدم الخطوط العريضة للخطوات الحاسمة في البروتوكول وأي تعديلات أو تحسينات قمنا بها.

هذا البروتوكول يبسط عمليه التمايز من hiPSCs مقارنه بالعمل المنشور سابقا25. الأساليب المستخدمة سابقا تتطلب نقل hiPSCs من نظم الثقافة Hipscs الأخرى (علي سبيل المثال ، المغذية Hipscs الثقافة) إلى المتوسطة المحددة كيميائيا-البولي فينيل الكحول (اليه-بفا). هذا النقل إلى اليه المعالجة النظيفة-بولي يستغرق عاده 2-3 أسابيع ويتطلب التغذية اليومية لل hiPSCs. كما ان هذا البروتوكول لم يكن فعالا باستمرار ، مع عدم وجود بعض الاختلافات ؛ ولذلك ، فاننا التمايز الثلاثي باستخدام نفس عوامل النمو ولكن بدءا من hiPSCs نمت في ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة (بدلا من اليه التنمية النظيفة-بولي) واستبدال اليه-بولي مع متوسط ثقافة الخلايا الجذعية خلال أيام التمايز 0-3. وقد نجح هذا الأمر بالنسبة للخطوط الخمسة لأفراس النهر المستقلة الثلاثة حتى الآن ، مما يجعل عمليه التمايز أكثر سرعه وكفاءه. وهذا يسمح أيضا لقضاء عطله نهاية الأسبوع خاليه من hiPSCs قبل التمايز ، مما يتيح المزيد من المرونة في ثقافة Hipscs. خطوط الهيدروغرافي التي تنتجها هذه الطريقة وقد تم النمط الظاهري لعلامات ظهاره المعوية كما وصفنا سابقا لخطوط hiPSC Kolf2 ، Yemz1 ، و Lise116 وتظهر تمييز ظاهريا من ihos المنتجة باستخدام السابق البروتوكول.

بعد البذر ، iHOs تتطلب ما لا يقل عن 1 شهر من المرور الروتيني ، مع تقسيم كل 4-7 أيام لتسهيل النضج. لاحظ انه سيكون هناك بعض الاختلاف في تطوير المعهد الهيدروغرافي الكتروني اعتمادا علي خط iPSC المستخدمة وكثافة الثقافة الاوليه. خلال المقاطع القليلة الاولي ، سيكون هناك تلوث واضح الخلايا التي ليست iHOs. هذه سوف يموت في نهاية المطاف ، وترك ثقافة نظيفه كرويه و ، بعد حوالي 4 أسابيع ، المبرعمه ihos. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام نظام التصوير في هود لتحديد ومرور iHOs فقط مع المورفولوجية المطلوب. وبما ان iHOs ناضجه ، فانها سوف تتطلب تقسيم كل 6-7 أيام ، تعتمد علي معدل النمو والكثافة. إذا حدث اي مما يلي ، يجب تقسيم iHOs قبل هذه النقطة: تجاويف الاناره من iHOs تبدا لملء مع الخلايا الميتة ، مصفوفة غشاء الطابق السفلي يبدا في التفكك ، و iHOs تبدا في النمو من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، أو الثقافة هي أيضا كثيفه ووسائل الاعلام تبدا في الذهاب الصفراء بسرعة كبيره.

وبمجرد ان يتم تاسيس ثقافة المعهد الهيدروغرافي الوطني ، إذا كان ظهور التغيرات في اي وقت أو يختلف عن المتوقع (علي سبيل المثال ، تظل الثقافات كرويه ، بدلا من المهد) ، يجب ان يكون التنميط الظاهري عبر مناعي ومؤشرات الخلايا المتكررة للتاكد من ان التفريق بين أنواع الخلايا داخل iHOs (علي سبيل المثال ، الخلايا القدح ، الخلايا Paneth) لا تزال سليمه. إذا كان iHOs لم تعد التفريق ، ثم ينبغي التخلص منها والتفريق أو المرور في وقت سابق من iHOs يجب ان تكون أذابه وأعاده تشكيلها. إذا توقف iHOs للتمييز ، والأسباب المحتملة هي عصر الثقافة (إذا كان أكثر من 6 أشهر من العمر) ، ونشاط عوامل النمو (ضمان ان يتم أعاده تشكيل هذه وفقا لتعليمات الشركات المصنعة وابقي المجمدة في الارصفه الصغيرة لتجنب عده دورات تجميد الذوبان) ، والممرات المتكررة جدا أو العنيفة (بشكل عام ، يجب ان يحدث المرور مره واحده في الأسبوع فقط ، وإذا تم فصل iHOs يدويا بقوة جدا علي أساس منتظم ، فانها سوف تتوقف عن التفريق بشكل كامل).

انشانا عن طريق التسلسل RNA ان آيل-22 التحفيز 18 ح قبل العدوى اوبريجولاتيس الجينات المضادة للميكروبات وتلك المشاركة في النمط الظاهري الدفاع الحاجز. قبل استخدام ihso الجديدة لمقايسات تنطوي علي المسبق مع rhil-22 (أو خلوي بديل إذا كان النظام قيد الاستخدام لهذا) ، فانه من المستحسن للتحقق من نشاط الجينات المعروف ان اوبريجولاتيد من قبل السايسيسين (في حاله IL-22 ، استخدمنا DUOX2 و LCN2) عبر Qpcr بعد تحفيز ihos ، لضمان التعبير مستقبلات والإشارات سليمه. قبل أول استخدام ل IL-22 ، ونحن أيضا نفذت مناعي لتحديد موقع مستقبلات IL-22 علي iHOs لإثبات ان التعبير عن مستقبلات IL-22 كان القاعدية ، وهذا يعني انه يمكن تحقيق التحفيز ببساطه عن طريق أضافه rhIL-22 إلى ثقافة الهيدروغرافي المتوسطه. ومع ذلك ، إذا تم التعبير عن مستقبلات بشكل غير ملائم ، قد يكون هذا البروتوكول ليتم تكييفها لتقديم يغاندس بشكل غير صحي.

وترتبط المزالق المتعلقة بنظام الحقن المجهري عموما بحساسية الابر المطلوبة للحقن. هنا ، ونحن نستخدم نصائح الحفر المتاحة تجاريا مع تجويف 6 μm. فمن الممكن لسحب ابر الحقن من الشعيرات الدموية الزجاجية26 علي الرغم من ان هذا قد يكون اقل موحده ، مما يؤدي إلى تسرب من طرف ابره أو احجام غير متناسقة يجري حقنها في ihos. ومن المهم التاكد من ان الحقن قد وقعت في تجويف الهيدروغرافي ، وهو سبب واحد لاستخدام الفينول الأحمر كصبغه ؛ سيتم توسيع iHOs بشكل واضح وعقد الاحمرار الأحمر ، مما يسمح اليقين حول التي تم حقن iHOs. في بعض الأحيان سوف تسد الابر مع الحطام من جدار الهيدروغرافي الخاص. إذا كانت هذه هي الحالة ، قم بازاله طرف الابره من داخل الشبكة الهيدروغرافية الكترونيه واضغط علي زر التنظيف علي نظام الحقن المجهري. وهذا سوف تنتج فتره وجيزة من ارتفاع ضغط الهواء الذي ينبغي ان مسح الانسداد. وسوف تحفز أيضا بعض تسرب من البكتيريا البكتيرية علي لوحه; لذلك ، إذا حدث هذا ، يجب ان تتكرر الإجراءات النظيفة علي جميع لوحات لضمان المساواة في البكتيريا البكتيرية لكل لوحه. واحده من المزايا الكبيرة لل iHOs المشتقة من hiPSC هي حجمها. العضوية المعوية من الفئران والعضوية البشرية الاوليه هي أصغر بكثير (قياس ما يصل إلى ~ 100 ميكرون و 100-300 ميكرومتر ، علي التوالي27، مقابل 250-1500 μm لل ihos المشتقة hipsc) ، وهذا يعني ان حقن كميات كبيره من organoids سيكون إبطا. وهذا يسمح لتجارب الحقن علي نطاق أوسع ان تكون ثلاثية في iHOs المشتقة hiPSC. ومن الممكن أيضا لدراسة محتويات الاناره من iHOs عن طريق حصاد لهم ما بعد الاصابه وفصل يدويا iHOs إلى DPBS ، والإفراج عن محتوياتها الاناره. للحقن المجهري ، نوصي باستخدام تركيز عال من البكتيريا. وجدنا ان تركيزات اقل لم تكن كافيه لتوليد استجابه من IECs تتالف من iHOs. بالاضافه إلى ذلك ، كان من الصعب في وقت لاحق تحديد موقع البكتيريا المستوعبة باستخدام المجهر. قد يكون من الممكن الحصول علي الأمثل لسلالات بكتيرية مختلفه.

وباختصار ، فان iHOs المشتقة من hiPSC توفر نموذجا واعدا لتشريح الاستجابة الظهاريه للالتهابات المعوية مباشره ، سواء عن طريق دراسة حسابات الغزو داخل الخلايا ، أو التصوير ، أو قياس مستويات السايسيسين في سوبرناتانتس الهيدروغرافي ، أو حصاد الجيش النيبالي الريبي دراسة التغيرات العابرة بعد التعرض لمسببات الامراض. وسوف تكون فائدتها أكثر وضوحا في المستقبل لإنشاء نماذج العدوى لمسببات الامراض المقيدة للإنسان وفي استغلال إمكانيات استخدام هذه التكنولوجيا لتخصيص البحوث عن طريق دراسة الطفرات الوراثية المرتبطة بالامراض المحددة والتصدي للمخدرات.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد حظي هذا العمل بالدعم بتمويل من مؤسسه ويلكوم ترست ، وغيتس ، ومركز كامبردج للبحوث الطبية الحيوية. جندي هو طالب الدكتوراه السريرية التي تدعمها الثقة Wellcome.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
5 mm glass bottom injection dishes MatTek corporation P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010
Alexa fluor 647 phalloidin Life Technologies A22287 Use at 1:1000 concentration
B27 serum-free supplement Life Technologies 17504044 Stock concentration 50x, final concentration 1x
BMP-4 recombinant human protein R&D PHC9534 Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL
Cell recovery solution (cell lifting solution) BD 354253
CHIR99021 Abcam  ab120890-5mg Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM
Collagenase, type IV powder Life Technologies 17104019 Reconstitute at 0.1%
Corning cryogenic vials Corning 430487
Costar TC treated 24 well culture plates Corning CLS3527
DAPI dilactate Sigma-Aldrich D9564-10MG Use at 10 nM concentration
Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) Life Technologies 14190-144
Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) Sigma-Aldrich D8662-100ML
Epidermal growth factor R&D 236-EG-200 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) Eppendorf 920000011
Eppendorf Femtojet express  (microinjection system) Eppendorf 5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) Life Technologies A2858501
EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)
Gentamicin Sigma-Aldrich G1272-10ML Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL
Goat anti-Salmonella, CSA-1 Insight Biotechnology 02-91-99 Use at 1:20 concentration
HEPES 1 M Life Technologies 15630056
KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) Gibco 10828010
GlutaMAX supplement (glutamine supplement ThermoFisher
L-glutamine Life Technologies A2916801 Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM
LY294002 Promega UK V1201 Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM
Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
MEM non-essential amino acids  solution (100x) Gibco 11140035
N2 serum-free supplement Life Technologies 17502048 Stock concentration 100x, final concentration 1x
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140163 Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL
Phenol red Sigma-Aldrich P0290-100ML
Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter Eppendorf 5195000087
Prostaglandin E2 Sigma P0409-1MG Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM
Recombinant human FGF basic R&D 233-FB-025 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human IL-22 R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recombinant human Noggin R&D 6057-NG-100 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL 
Recombinant human R-spondin1 R&D 4645-RS-025 Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL
Recombinant human/mouse/rat Activin A R&D 338-AC-050 Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL
Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) Gibco 12648010
Retinoic acid Sigma-Aldrich  R2625-50MG Stock concentration 3μM, final concentration 3mM
RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) Life Technologies 61870010
Triton X-100 (cell lysis buffer) Sigma-Aldrich RES9690T-A101X Use at 1% concentration
Versene (EDTA solution) Life Technologies 15040066
Vitronectin XF Stemcell Technologies  7180
Y-27632 dihydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich Y0503-1MG Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  2. Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  5. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  6. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
  7. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
  8. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  9. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  10. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
  11. Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
  14. Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).
  15. Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
  16. Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
  17. Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
  18. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  19. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  20. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  21. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
  22. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
  23. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  24. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  25. Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
  26. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  27. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsEpithelial Cell ProtectionSalmonellaPathogensMicro-injectionDifferentiationRPMI-B27 MediaCHIR99021Retinoic AcidBasement Membrane MatrixCollagenaseOrganoid Base Growth MediaCentrifugation24-well Plate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lees, E. A., Forbester, J. L., Forrest, S., Kane, L., Goulding, D., Dougan, G. Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens. J. Vis. Exp. (147), e59478, doi:10.3791/59478 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image