Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli
Summary
Alkolsüz steatohepatiti için basit ve güvenilir bir diyet kaynaklı kemirgen hayvan modeli (NASH) tarif edilir, hayvanlar ve özel bir yüksek yağ diyet uygulanması SPF olmayan konut aracılığıyla elde. Biz karaciğer ve adipoz immün hücre alt kümeleri tanımlamak için insan immünolojik koşulları farları çevresel mikroplar maruz tarafından yeniden tanımlamakta.
Abstract
Obezite kronik düşük dereceli inflamasyon ve insülin direnci ile ilişkilidir, tip 2 diyabet ve alkolsüz steatohepatitler (NASH) gibi kronik metabolik hastalıkların artan prevalansı katkıda bulunur. Son araştırmalar, Pro-inflamatuar immün hücrelerin obez hipertrofik yağ dokusu ve karaciğer infiltrasyon kurdu. Metabolik homeostaz bağlamında bağışıklık hücrelerinin ortaya çıkan önemi göz önüne alındığında, kritik bir ihtiyaç türü 2 diyabet ve NASH gelişimi sırasında değişiklik ölçmek ve karakterize etmektir. Ancak, insan NASH tipik patofizyolojik özellikleri neden hayvan modelleri seyrek vardır.
Bu yazıda, yüksek yağlı diyet (HFD) fareler tarafından kurulan, özel olmayan patojen içermeyen (SPF) koşullar altında, bir NASH ‘in güvenilir bir fare modelinde karaciğer ve adipoz dokusundan izole edilen bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. en az yedi hafta için bariyer. SPF olmayan koşullarda farelerin işlenmesini, dokuların sindirimi ve makrofajların, doğal katil (NK) hücrelerinin, dendritik hücrelerin, B ve T hücresi alt setlerinin akış sitometri tarafından belirlenmesini gösteriyoruz. SPF HFD fareler ve SPF olmayan farelerden temsilci akış sitometri araziler sağlanmaktadır. Güvenilir ve yorumlanabilir veriler elde etmek için, antikorların kullanımı, doku sindirimi için doğru ve hassas Yöntemler ve akış sitometri deneylerinde uygun şekilde gating önemli unsurlardır.
SPF dışı koşullarda ve mikrobiyal antijenlere spesifik olmayan maruz kalmalarına neden olan farelerde fizyolojik antijen pozlamasını geri yükleme müdahalesi, immünolojik değişiklikler arasındaki bağlantıyı araştırmak için ilgili bir araç sağlayabilir, diyet kaynaklı Obezite ve ilgili uzun vadeli komplikasyonlar.
Introduction
Obezite multifokal bir bozukluk ve kalp hastalığı, inme, alkolsüz steatohepatit (NASH), tip 2 diyabet (T2D) ve bazı kanser türleri geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür. Obezite prevalansı hızla küresel olarak artmaktadır. Bugün, 2.100.000.000 kişi-dünyanın nüfusu yaklaşık% 30-ya obez ya da kilolu1vardır. Obezite-ilişkili insülin direnci T2D için yol açabilir, zaman tükenmiş pankreatik Islet Beta hücreleri glikoz homeostazı korumak için insülin için artan ihtiyaç telafi etmek için başarısız2.
Adipoz dokusu adipanosit, endotel hücreler, fibroblastlar ve immün hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre türlerinden oluşur. Obezitenin ilerlemesi sırasında, immün hücrelerin sayısının ve aktivitesindeki değişiklikler hipertrofik adipoz dokusunun düşük dereceli iltihaplanmasına yol açabilir3,4. Özellikle, aşırı enerji alımı, kronik yüksek kan şekeri, trigliserid ve serbest yağ asitleri seviyeleri ile birlikte, adiposit hipoksi, endoplazmik retikulum stres, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon ve yol açar bulunmuştur Gelişmiş sitokin salgılanması, Pro-inflamatuar yağ immün hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanan5,6. Geçmiş araştırmalar esas olarak doğuştan gelen bağışıklık odaklı, ama daha yakın zamanda adaptif bağışıklık hücreleri (T ve B hücreleri) glikoz homeostaz önemli regülatörler olarak ortaya çıkmıştır. İnflamatuar (CD8+ T hücreleri, Th1 ve B hücreleri dahil) veya öncelikle düzenleyici fonksiyonlar (düzenleyici T (Treg) hücreleri, TH2 hücreleri dahil) ve hem şiddetlendirebilir ya da insülin direnci karşı korumak7,8 , 9‘ a kadar.
Ayrıca, obezite steatohepatiti nasıl artırdığını açıklamak için çeşitli mekanizmalar önerildi, adipoz dokusu ile sitokinlerin artan üretimi de dahil olmak üzere10. Fizyolojik olmayan yağlı karaciğer hastalığının ilerici formu ve gelişmiş ülkelerde büyük bir sağlık yükünü kullanarak histolojik olarak balonlu hepatositler, lipid birikimi, fibrozis ve perikelüler inflamasyon ile karakterize edilir ve Siroz, son aşama karaciğer hastalığı veya hepatosellüler karsinom. Çeşitli rejim (örneğin metiyonin ve kolin eksikliği diyet11) olmayan insan hayvan modellerinde Nash benzeri karaciğer patolojisine neden olduğu bilinmektedir, ama bu yaklaşımların çoğu Nash insan koşulları ve metabolik özetlemek yok Onlar ya spesifik gen nakavt, fizyolojik olmayan diyet manipülasyonları veya eksikliği insülin direnci insan NASH tipik gerektirir gibi sonuçlar. Ayrıca, metabolik hastalıkların temel mekanizmalarının anlayışımız Şu anda standart spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında bulunan laboratuar fareler ile yürütülen deneyler dayanmaktadır. Bu bariyer tesisleri anormal hijyen ve insanlar karşılaşmak zorunda mikrobiyal çeşitlilik dikkate değil, hangi klinik yaklaşımlar hayvan çalışmaları çeviri sürecinde zorluklar için hesap olabilir12,13 , 14oldu.
İnsan immünolojik koşulları üreten gelişmiş bir fare modelinde insülin direnci ve Nash gelişimi sırasında adipoz doku ve karaciğer farklı immün hücre alt kümeleri araştırmak için, fareler yarı steril bireysel kafeslerde yer aldı Bariyersiz koşullar. Fareler antijen maruz koşullar altında bulunan NASH-benzeri karaciğer patolojisi zaten 15 hafta yüksek yağlı diyet (HFD) besleme13sonra geliştirilmiştir. Yaş eşlemeli SPF fareler ile karşılaştırıldığında macrovesicular steatosis, hepatik infiltrasyon ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu geliştirdi.
Bu yazıda, NASH modelinde fare adipoz dokusu ve karaciğerinden bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak ve saymak için sağlam bir akış sitometri Analizi açıklanmaktadır. Akış sitometri analizi, RT-PCR veya immünhistokimya yaklaşımlarının aksine, tek hücrelerin birden çok parametrenin aynı anda algılanmasını sağlar.
Özetle, bizim çalışma insülin direnci ve NASH ve aynı zamanda insan durumuna sadakat sergiler altta yatan mekanizmaları gelişimini araştırmak için kısa vadeli HFD bir fare modeli sunuyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steatohepatitin obezite, insülin direnci ve dislipidemi15gibi metabolik anomaliler ile güçlü bir ilişkisi vardır. Çoklu çalışmalar, yağ doku iltihabı tip 2 diyabet patogenezi sürücü olduğunu gösterir, hem doğuştan ve adaptif bağışıklık sistemi hücreleri değişen seviyeleri de dahil olmak üzere4,5,16,17 . Buna ek olarak, obezite karaciğer kompl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz deneysel prosedürler ve gating stratejisi üzerinde yararlı yorumlar için Biolegend gelen Benjamin Tiburzy yardım için Anke hukuk, Diana Woellner, Dr Kathrin Witte ve Cornelia Heckmann teşekkür ederiz. JS, Helmholtz Grant (ıCEMED) tarafından destekleniyordu. Bu çalışmada, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı ve Einstein Vakfı tarafından “BCRT-Grant” Berlin Sağlık Enstitüsü (BH) klinik araştırma birimi ‘nden hibe tarafından destekleniyordu. KAHRAMAN-B. ve H.-D.V. tarafından finanse edilir FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
