Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2
Summary
Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.
Abstract
La obesidad se asocia con la inflamación crónica de bajo grado y la resistencia a la insulina, contribuyendo a una creciente prevalencia de enfermedades metabólicas crónicas, como la diabetes tipo 2 y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Investigaciones recientes han establecido que las células inmunes pro-inflamatorias infiltran tejido adiposo hipertrófico obeso y el hígado. Dada la importancia emergente de las células inmunitarias en el contexto de la homeostasis metabólica, hay una necesidad crítica de cuantificar y caracterizar su modificación durante el desarrollo de la diabetes tipo 2 y NASH. Sin embargo, los modelos animales que inducen características fisiopatológicas típicas del NASH humano son escasos.
En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para identificar subconjuntos de células inmunitarias aisladas del hígado y el tejido adiposo en un modelo de ratón confiable de NASH, establecido por la vivienda de ratones con dieta alta en grasas (HFD) bajo condiciones no específicas de patógenos (SPF) sin un barrera durante al menos siete semanas. Demostramos el manejo de ratones en condiciones no SPF, digestión de los tejidos y la identificación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), células dendríticas, B y células T subconjuntos por citometría de flujo. Se proporcionan diagramas de citometría de flujo representativos de ratones con SPF HFD y ratones que no son SPF. Para obtener datos fiables e interpretables, el uso de anticuerpos, métodos precisos y precisos para la digestión de los tejidos y la correcta compuerta en los experimentos de citometría de flujo son elementos críticos.
La intervención para restaurar la exposición fisiológica del antígeno en ratones alojándolos en condiciones no SPF y la exposición no específica a antígenos microbianos podría proporcionar una herramienta relevante para investigar el vínculo entre las alteraciones inmunológicas, inducida por la dieta obesidad y complicaciones relacionadas a largo plazo.
Introduction
La obesidad es un trastorno multifactorial y un factor de riesgo importante para desarrollar enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes tipo 2 (T2D) y algunos tipos de cáncer. La prevalencia de la obesidad está aumentando rápidamente en todo el mundo. Hoy en día, 2,1 mil millones personas — casi el 30% de la población mundial — son obesas o con sobrepeso1. La resistencia a la insulina asociada a la obesidad puede conducir a T2D, cuando las células beta del islote pancreático agotado no logran compensar la mayor necesidad de insulina para mantener la la homeostasis de la glucosa2.
El tejido adiposo se compone de varios tipos de células, incluyendo adipocitos, células endoteliales, fibroblastos y células inmunitarias. Durante la progresión de la obesidad, los cambios en el número y la actividad de las células inmunitarias pueden provocar una inflamación de bajo grado del tejido adiposo hipertrófico3,4. Específicamente, se ha encontrado que la ingesta excesiva de energía, acompañada de niveles crónicamente elevados de glucosa en sangre, triglicéridos y ácidos grasos libres, conduce a la hipoxia adipocíta, estrés retículo endoplásmico, deterioro de la función mitocondrial y mejora de la secreción de citoquinas, lo que resulta en la activación de las células inmunitarias proinflamatorias de la adiposa5,6. Investigaciones pasadas se han centrado principalmente en la inmunidad innata, pero más recientemente las células inmunes adaptables (células T y B) han surgido como reguladores importantes de la homeostasis de la glucosa. Poseen inflamatorios (incluyendo células t CD8+ , Th1, y células B) o principalmente funciones regulatorias (incluyendo células reguladoras t (treg), células Th2) y pueden exacerbar o proteger contra la resistencia a la insulina7,8 , 9.
Además, se propusieron varios mecanismos para explicar cómo la obesidad aumenta la esteatohepatitis, incluyendo el aumento de la producción de citoquinas por tejido adiposo10. NASH, la forma progresiva de hígado graso no alcohólico y una importante carga sanitaria en los países desarrollados, se caracteriza histológicamente por los hepatocitos en globo, la acumulación de lípidos, la fibrosis y la inflamación pericelular y puede progresar hasta cirrosis, enfermedad hepática terminal o carcinoma hepatocelular. Varios régimen (por ejemplo, la dieta deficiente de metionina y colina11) se sabe que inducen la patología hepática como Nash en modelos animales no humanos, pero la mayoría de estos enfoques no recapitulan las condiciones humanas de Nash y su metabolismo consecuencias, ya sea que requieran un nocaut genético específico, manipulaciones dietéticas no fisiológicas o la falta de resistencia a la insulina típica de NASH humano. Por otra parte, nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas se basa actualmente en experimentos llevados a cabo con ratones de laboratorio alojados bajo condiciones estándar específicas libres de patógenos (SPF). Esas instalaciones de barrera son anormalmente higiénicas y no consideran la diversidad microbiana que los seres humanos tienen que encontrar, lo que puede tener en cuenta las dificultades en el proceso de traducción de los estudios en animales a los enfoques clínicos12,13 , 14.
Para investigar los diferentes subconjuntos de células inmunes en el tejido adiposo y el hígado durante el desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH en un modelo avanzado de ratón que reproduce las condiciones inmunológicas humanas, los ratones se alojaron en jaulas individuales en semi estéril condiciones sin barreras. Los ratones alojados bajo condiciones expuestas al antígeno desarrollaron patología hepática como la de NASH ya después de 15 semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD)13. En comparación con los ratones SPF adaptados a la edad, desarrollaron esteatosis macrovesicular, infiltración hepática y activación de células inmunitarias.
Este manuscrito describe un análisis robusto de citometría de flujo para definir y contar subconjuntos de células inmunitarias del tejido adiposo del ratón y del hígado en un modelo de NASH. El análisis de citometría de flujo permite la detección de múltiples parámetros de células individuales simultáneamente en contraste con los enfoques RT-PCR o inmunohistoquímica.
En Resumen, nuestro estudio ofrece un modelo de ratón de HFD a corto plazo para la investigación del desarrollo de la resistencia a la insulina y NASH y los mecanismos subyacentes que también exhibe la fidelidad a la condición humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
La esteatohepatitis tiene una fuerte asociación con anomalías metabólicas como la obesidad, la resistencia a la insulina y la dislipidemia15. Varios estudios indican que la inflamación del tejido adiposo puede conducir la patogénesis de la diabetes tipo 2, incluidos los niveles alterados de células del sistema inmunitario innato y adaptativo4,5,16,17 . Además, se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Anke Jurisch, Diana Woellner, Dra. Kathrin Witte y Cornelia Heckmann la asistencia con procedimientos experimentales y Benjamin Tiburzy de Biolegend para comentarios útiles sobre la estrategia de la puerta. J.S. fue apoyado por la beca Helmholtz (ICEMED). Este estudio fue apoyado por becas de la unidad de investigación clínica del Instituto de salud de Berlín (BIH), el “BCRT-Grant” por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación y la Fundación Einstein. K.S.-B. y H.-D.V. son financiados por FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
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