Расширенный murine модель безалкогольный стеатогепатит в ассоциации с сахарным диабетом 2 типа
Summary
Простая и надежная диета индуцированной грызунов животных модель безалкогольного стеатогепатит (Нэш) описывается, достигается за счет не-SPF жилья животных и администрация конкретного высокого жира диета. Мы описываем определение печени и жировой подмножеств иммунных клеток, чтобы резюмировать человеческие иммунологические условия, подвергая мышей к экологическим ростков.
Abstract
Ожирение связано с хроническим низкосортным воспалением и инсулинорезистентностью, способствуя увеличению распространенности хронических метаболических заболеваний, таких как диабет 2 типа и безалкогольный стеатогепатит (Нэш). Недавние исследования установили, что про-воспалительные иммунные клетки проникают ожирением гипертрофической жировой ткани и печени. Учитывая возникающим важность иммунных клеток в контексте метаболического гомеостаза, существует критическая потребность в количественной оценке и характеризуют их модификации во время развития диабета 2 типа и НЭГ. Однако, Животные модели, которые индуцируют Патофизиологические особенности, характерные для человеческого НЭША, редки.
В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выявления иммунных подмножеств клеток, изолированных от печени и жировой ткани в надежной модели мыши НАСГ, установленных жилья с высоким содержанием жиров (HФД) мышей в неспецифической без патогена (SPF) условия, не барьер не менее семи недель. Мы демонстрируем обработку мышей в не-SPF условиях, переваривание тканей и выявление макрофагов, естественных киллеров (НК) клеток, дендритных клеток, B и т-клеток подмножеств потока цитометрии. Предоставляются репрезентативные потоки тометриметрии от мышей SPF и не-SPF. Для получения надежных и интерпретируя данных, использование антител, точных и точных методов для переваривания тканей и правильного стробирования в опытах цитометрии являются важнейшими элементами.
Вмешательство для восстановления физиологических воздействия антигена у мышей на жилье их в не-SPF условиях и неспецифическое воздействие микробных антигенов может обеспечить соответствующий инструмент для исследования связи между иммунологическими изменениями, диета индуцированной Ожирение и связанных с ними долгосрочных осложнений.
Introduction
Ожирение является многофакторным расстройством и основным фактором риска развития сердечных заболеваний, инсульта, безалкогольного стеатогепатита (Нэш), диабета 2 типа (T2D) и некоторых видов рака. Распространенность ожирения стремительно возрастает во всем мире. Сегодня 2 100 000 000 человек — почти 30% населения мира — страдают ожирением или имеют избыточный вес1. Ожирение-ассоциированные инсулинорезистентность может привести к T2D, когда исчерпаны поджелудочной железы островок бета-клеток не в состоянии компенсировать повышенную потребность в инсулине для поддержания глюкозы гомеостаза2.
Жировая ткань состоит из различных типов клеток, включая адипоциты, эндотелиальные клетки, фибробласты и иммунные клетки. При прогрессировании ожирения изменения количества и активности иммунных клеток могут приводить к низкосортных воспалений гипертрофической жировой ткани3,4. В частности, было установлено, что чрезмерное потребление энергии, сопровождается хронически повышенный уровень глюкозы в крови, триглицеридов и свободных жирных кислот, приводит к адипоцита гипоксии, эндоплазматический ретикулум стресс, нарушение митохондриальной функции и усиление секреции цитокинов, приводящее к активации про-воспалительных жировой иммунной клетки5,6. Прошлые исследования в основном сосредоточены на врожденный иммунитет, но в последнее время адаптивные иммунные клетки (т и в клетки) появились как важные регуляторы гомеостаза глюкозы. Они обладают воспалительными (в том числе CD8+ т-клеток, Th1 и B-клеток) или в первую очередь нормативные функции (в том числе нормативных т (TREG) клетки, Th2 клетки) и может как усугубить или защитить от инсулинорезистентности7,8 , 9. в
Кроме того, несколько механизмов было предложено объяснить, как ожирение увеличивает стеатогепатит, в том числе увеличение производства цитокинов жировой ткани10. Нэш, Прогрессивная форма безалкогольного жирных заболеваний печени и основных бремени для здоровья в развитых странах, гистологически характеризуется раздутый гепатоциты, накопление липидов, фиброз и периклеклеточного воспаления и может прогрессировать до Цирроз, стадия заболевания печени на конечной стадии или гео-клеточная карцинома. Некоторые схемы (например, метионин и холин дефицит диета11), как известно, ИНДУЦИРОВАТЬ Нэш-подобный патологии печени в не-человеческого животных моделей, но большинство из этих подходов не резюмировать человеческие условия НЭО и его метаболические последствия, поскольку они либо требуют конкретных ген нокаутом, не физиологические диетические манипуляции или отсутствие резистентности к инсулину типичный человеческий Нэш. Кроме того, наше понимание основных механизмов метаболических заболеваний в настоящее время основывается на экспериментах, проведенных с лабораторными мышами, размещенный под стандартными конкретными патогеном свободными (SPF) условиями. Эти барьерные сооружения являются аномально гигиеничными и не учитывают микробное разнообразие, с которым приходится сталкиваться людям, что может учитывать трудности в процессе перевода исследований на животных к клиническим подходам12,13 , 14-ое.
Для исследования различных иммунных подмножеств клеток в жировой ткани и печени во время развития инсулинорезистентности и Нэш в продвинутой модели мыши воспроизводства человеческих иммунологических состояний, мышей были размещены в отдельных клетках в полу стерильных условия без барьера. Мыши, размещенный под антигеном подвергается условий развитых Нэш-подобных патологии печени уже после 15 недель с высоким содержанием жиров диеты (ДФД) кормления13. По сравнению с возрастом, сопрягаемом SPF мышей они разработали макровезикулярного стеатоза, печеночной инфильтрации и активации иммунных клеток.
Эта рукопись описывает надежный анализ расхода цитометрии для определения и подсчета подмножеств иммунных клеток из жировой ткани мыши и печени в модели НЭША. Анализ расхода цитометрии позволяет обнаруживать множественные параметры отдельных клеток одновременно, в отличие от подходов РТ-ЦР или иммуногистохимии.
Таким образом, наше исследование предлагает мышь модель краткосрочного HФД для исследования развития резистентности к инсулину и Нэш и основные механизмы, которые также экспонатов верность состояния человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стеатогепатит имеет сильную связь с метаболическими аномалиями, такими как ожирение, инсулинорезистентность и дислипидемия15. Многочисленные исследования показывают, что воспаление жировой ткани может стимулировать патогенез диабета типа 2, включая измененные уровни кл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Анке Журисч, Диана Woellner, д-р Катрин Витте и Корнелии Хекманн за помощь в экспериментальных процедурах и Бенджамин Tiburzy из Билегенда для полезные замечания по стратегии стробирования. И.С. был поддержан грантом Гельмхольца (ICEMED). Это исследование было поддержано грантами из отдела клинических исследований Берлинского института здравоохранения (БиГ), «БЭЛТ-гранта» федеральным министерством образования и исследований Германии и Фондом Эйнштейна. К.С.-Б. и H.-Д.В. финансируются FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
