Um modelo murino avançado para esteatohepatite não alcoólica em associação com diabetes tipo 2
Summary
Um modelo animal da dieta-induzido simples e de confiança do roedor para o esteatohepatite não alcoólico (Nash) é descrito, conseguido com a carcaça non-SPF dos animais e a administração de uma dieta high-fat específica. Nós descrevemos a identificação de subconjuntos hepatic e adiposos da pilha imune para recapitular condições imunológicas humanas expondo ratos aos germes ambientais.
Abstract
A obesidade está associada à inflamação crônica de baixo grau e à resistência insulínica, contribuindo para uma crescente prevalência de doenças metabólicas crônicas, como diabetes tipo 2 e esteatohepatite não alcoólica (NASH). Pesquisas recentes estabeleceram que as células imunes pró-inflamatórias infiltram o tecido adiposo hipertrófico obeso e o fígado. Dada a importância emergente das células imunes no contexto da homeostase metabólica, há uma necessidade crítica de quantificar e caracterizar sua modificação durante o desenvolvimento de diabetes tipo 2 e NASH. Entretanto, os modelos animais que induzem características patofisiológicas típicas do NASH humano são escassos.
Neste artigo, nós fornecemos um protocolo detalhado para identificar os subconjuntos da pilha imune isolados do fígado e do tecido adiposo em um modelo de rato de confiança de NASH, estabelecido por ratos da dieta high-fat da carcaça (HFD) condições patogénicos não específicas-livres (SPF) sem barreira por pelo menos sete semanas. Demonstramos o manuseio de camundongos em condições não-SPF, digestão dos tecidos e identificação de macrófagos, células do assassino natural (NK), células dendríticas, subconjuntos de células B e T por citometria de fluxo. Parcelas representativas de citometria de fluxo de camundongos SPF HFD e camundongos não-SPF são fornecidas. Para obter dados confiáveis e interpretáveis, o uso de anticorpos, métodos precisos e precisos para a digestão dos tecidos e a boa gating em experimentos de citometria de fluxo são elementos críticos.
A intervenção para restaurar a exposição fisiológica de antígenos em camundongos por habitá-los em condições não-SPF e exposição inespecífica a antígenos microbianos poderia fornecer uma ferramenta relevante para investigar a ligação entre alterações imunológicas, induzida por dieta obesidade e complicações relacionadas a longo prazo.
Introduction
A obesidade é um transtorno multifatorial e um importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardíacas, AVC, esteatohepatite não alcoólica (NASH), diabetes tipo 2 (DM2) e alguns tipos de câncer. A prevalência da obesidade está aumentando rapidamente globalmente. Hoje, 2.100.000.000 pessoas — quase 30% da população mundial — são obesas ou com sobrepeso1. A resistência à insulina associada à obesidade pode levar a dm2, quando as células beta de Islet pancreáticas esgotadas não compensam a necessidade aumentada de insulina para manter a homeostase da glicose2.
O tecido adiposo é composto de vários tipos de células, incluindo adipócitos, células endoteliais, fibroblastos e células imunes. Durante a progressão da obesidade, as alterações no número e atividade das células imunes podem levar a inflamação de baixo grau do tecido adiposo hipertrófico3,4. Especificamente, verificou-se que a ingestão excessiva de energia, acompanhada de níveis cronicamente elevados de glicose no sangue, triglicérides e ácidos graxos livres, leva à hipóxia adipócitos, estresse retículo endoplasmático, função mitocondrial prejudicada e secreção de citocinas aprimorada, resultando na ativação de células imunes adiposas pró-inflamatórias5,6. Pesquisas anteriores centraram-se principalmente na imunidade inata, mas as células imunes mais recentemente adaptativas (células T e B) surgiram como importantes reguladores da homeostase da glicose. Possuem células inflamatórias (incluindo células CD8+ t, Th1 e B) ou principalmente funções regulatórias (incluindo células reguladoras t (TREG), células Th2) e podem exacerbar ou proteger contra a resistência à insulina7,8 , noveanos.
Além disso, vários mecanismos foram propostos para explicar como a obesidade aumenta a esteatohepatite, incluindo o aumento da produção de citocinas pelo tecido adiposo10. NASH, a forma progressiva de doença hepática gordurosa não alcoólica e uma grande carga de saúde em países desenvolvidos, é histologicamente caracterizada por hepatócitos balados, acúmulo de lipídios, fibrose e inflamação pericelular e pode progredir para cirrose, doença hepática em estágio terminal ou carcinoma hepatocelular. Vários regimes (por exemplo, a dieta deficiente de metionina e colina11) são conhecidos por induzir a patologia hepática semelhante a Nash em modelos animais não humanos, mas a maioria dessas abordagens não recapitulam as condições humanas de Nash e seus metabólicos consequências, uma vez que necessitam de nocaute genético específico, manipulações dietéticas não fisiológicas ou falta de resistência insulínica típica da NASH humana. Além disso, nossa compreensão dos mecanismos subjacentes de doenças metabólicas baseia-se atualmente em experimentos realizados com camundongos laboratoriais alojados em condições padrão específicas de patógenos livres (SPF). Essas instalações de barreira são anormalmente higiênicas e não consideram a diversidade microbiana que os seres humanos têm de encontrar, o que pode explicar dificuldades no processo de tradução de estudos em animais para abordagens clínicas12,13 , o 14.
Para investigar os subconjuntos diferentes da pilha imune no tecido adiposo e no fígado durante o desenvolvimento da resistência de insulin e do NASH em um modelo avançado do rato que reproduz circunstâncias imunológicas humanas, os ratos foram alojados em gaiolas individuais no semi estéril condições sem uma barreira. Os ratos abrigados condições expostas do antígeno desenvolveram a patologia do fígado NASH-like já após 15 semanas da alimentação High-Fat da dieta (HFD)13. Comparados aos ratos SPF idade-combinados desenvolveram o Steatosis macrovesicular, a infiltração hepatic e a ativação de pilhas imunes.
Este manuscrito descreve uma análise de citometria de fluxo robusta para definir e contar subconjuntos de células imunes do tecido adiposo do camundongo e do fígado em um modelo de NASH. A análise da citometria do fluxo permite a deteção de parâmetros múltiplos de pilhas individuais simultaneamente no contraste ao RT-PCR ou às aproximações immunohistochemistry.
Em suma, nosso estudo oferece um modelo de mouse de HFD de curto prazo para investigar o desenvolvimento de resistência insulínica e NASH e os mecanismos subjacentes que também exibem fidelidade à condição humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
A esteatohepatite tem forte associação com anormalidades metabólicas como obesidade, resistência insulínica e dislipidemia15. Os estudos múltiplos indicam que a inflamação do tecido adiposo pode conduzir a patogénese do tipo-diabetes 2, incluindo níveis alterados de pilhas do sistema imune inata e adaptável4,5,16,17 . Além disso, verificou-se que a obesidade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann por assistência com procedimentos experimentais e Benjamin Tiburzy de Biolegend para comentários úteis sobre a estratégia de gating. J.S. foi apoiado pelo Grant de Helmholtz (ICEMED). Este estudo foi apoiado por subsídios da unidade de pesquisa clínica do Instituto de saúde de Berlim (BIH), o “BCRT-Grant” pelo Ministério Federal alemão de educação e pesquisa e da Fundação Einstein. -B. e H.-D.V. são financiados por FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
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