2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル
Summary
非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) に対する簡便で信頼性の高い食餌誘発げっ歯類動物モデルについては、特定の高脂肪食の動物及び投与の SPF 以外の住居を通じて達成される。我々は、マウスを環境細菌に曝露することにより、ヒトの免疫学的状態を不在するための肝および脂肪免疫細胞サブセットの同定について述べる。
Abstract
肥満は、慢性的な低品位の炎症およびインスリン抵抗性と関連しており、2型糖尿病および非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) などの慢性代謝性疾患の罹患率の増加に寄与している。最近の研究では、炎症性免疫細胞が肥満の肥大脂肪組織と肝臓に潜入することを確立しています。代謝恒常性の文脈における免疫細胞の重要性の出現を考えると、2型糖尿病と NASH の発症中にそれらの修飾を定量化し、特徴付けることが重要な必要性がある。しかしながら、ヒト NASH の典型である病態生理学的特徴を誘導する動物モデルはまばらである。
本稿では、非特異的病原体を含まない (HFD) マウスによって確立された NASH の信頼できるマウスモデルにおける肝臓および脂肪組織から分離された免疫細胞サブセットを同定するための詳細なプロトコルを提供する。少なくとも7週間の障壁.我々は、非 SPF 条件でのマウスの取扱い、組織の消化およびマクロファージ、ナチュラルキラー (NK) 細胞、樹状細胞、B および T 細胞サブセットの同定をフローサイトメトリーによって示す。SPF HFD マウスおよび非 SPF マウスからの代表的なフローサイトメトリープロットが提供される。信頼性が高く解釈されたデータを得るためには、抗体の使用、組織消化のための正確かつ正確な方法、およびフローサイトメトリーの実験における適切なゲーティングが不可欠です。
非 SPF 条件でそれらを収容することによって、マウスにおける生理的抗原曝露を回復するための介入および微生物抗原への非特異的暴露は、免疫学的変化の間のリンクを調査するための関連したツールを提供することができ、食餌誘発肥満および関連する長期合併症。
Introduction
肥満は多因子性障害であり、心臓疾患、脳卒中、非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH)、2型糖尿病 (T2D) およびある種の癌を発症する主要な危険因子である。肥満の罹患率は急速に世界的に増加している。今日では、世界の人口の約 30% に21億人が肥満または太り気味の1です。肥満関連インスリン抵抗性は、T2D につながる可能性があり、枯渇した膵島ベータ細胞がグルコースホメオスタシス2を維持するためにインスリンの必要性の増大を補うのに失敗する。
脂肪組織は、脂肪細胞を含む様々な細胞タイプ、内皮細胞、線維芽細胞および免疫セルから構成される。肥満の進行中に、免疫細胞の数および活性の変化は、肥厚性脂肪組織の低悪性度の炎症をもたらす可能性があります3,4.具体的には、過剰なエネルギー摂取が、慢性的に上昇した血糖値、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸を伴うことが、脂肪細胞低酸素症、小胞体ストレス、ミトコンドリア機能障害をもたらす、サイトカイン分泌の亢進は、炎症性脂肪免疫細胞5,6の活性化をもたらす。これまでの研究は自然免疫に着目してきましたが、最近では適応免疫細胞 (T 細胞、B 菌) がグルコース恒常性の重要な調節因子として浮上しています。それらは、炎症性 (CD8+ T 細胞、Th1、および B 細胞を含む) または主に調節機能 (調節 T (Treg) 細胞、Th2 細胞を含む) を有し、そしてインスリン抵抗性7、8に対して両方を増悪または保護することができる,9.
さらに、脂肪組織10によるサイトカインの産生増加を含めた肥満が脂肪肝炎を増加させる方法を説明するためのいくつかのメカニズムが提案された。NASH は、先進国における非アルコール性脂肪肝疾患と主要な健康負担の進行性形態であり、組織学的にはバルーン化された肝細胞、脂質蓄積、線維症および pericellular 炎症を特徴とし、進行肝硬変、末期肝疾患または肝細胞癌。いくつかのレジメン (例えばメチオニンおよびコリン欠乏性食餌11) は、非ヒト動物モデルにおいて NASH 様肝病理を誘発することが知られているが、これらのアプローチのほとんどは、nash 及びその代謝のヒト状態を不在しない結果は、それらが特定の遺伝子ノックアウト、非生理的食物操作を必要とするか、またはヒト NASH の典型的なインスリン抵抗性を欠いている。さらに、代謝性疾患の根底にあるメカニズムに関する我々の理解は、現在、標準特定病原体フリー (SPF) 条件下に収容された実験室マウスで行われる実験に基づいている。これらのバリア施設は異常に衛生的であり、人間が遭遇しなければならない微生物の多様性を考慮していないため、動物実験の翻訳プロセスが困難である可能性がある。臨床アプローチ12,13,14です。
ヒトの免疫学的状態を再現する高度なマウスモデルにおけるインスリン抵抗性および NASH の発症中の脂肪組織および肝臓における異なる免疫細胞サブセットを調査するために、マウスを半無菌で個々のケージに収容した障壁のない条件。抗原暴露状態の下に収容されたマウスは、既に15週目の高脂肪食 (HFD) 摂食13の後に NASH 様肝病理を発症した。年齢に一致した SPF マウスと比較して、彼らは macrovesicular 脂肪症、肝浸潤および免疫細胞の活性化を開発しました。
本稿では、マウスの脂肪組織と肝臓からの免疫細胞サブセットを NASH のモデルとして定義・カウントする、頑健なフローサイトメトリー解析について述べる。フローサイトメトリー解析により、RT-PCR または免疫組織化学アプローチとは対照的に、個々の細胞の複数のパラメータを同時に検出することができます。
要約すると、我々の研究は、インスリン抵抗性および NASH の発症を調査するための短期 HFD のマウスモデルと、人間の状態に対しても忠実さを示す基礎的なメカニズムを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂肪性肝炎は、肥満、インスリン抵抗性および脂質異常症15などの代謝異常との強い関連を有する。複数の研究は、脂肪組織の炎症は、先天性および適応免疫系の両方の細胞の変化したレベルを含む2型糖尿病の病因を駆動することができることを示しています4,5,16,17.さらに、肥…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
学 Jurisch、ダイアナ Woellner、キャスリンウィッテとコーネリア・ヘックマンは、ゲーティング戦略に関する有用なコメントを Tiburzy からの実験的な手順とベンジャミン・ Biolegend の支援のために感謝しています。J.S. は、ヘルムホルツ許可 (ICEMED) によって支持されました。この研究は、ベルリン健康研究所 (ボスニア・ヘルツェゴビナ)、ドイツ連邦教育研究省とアインシュタイン財団の「BCRT」の臨床研究ユニットからの助成金によって支援されました。K.S.-B.そして、h. D.V. は FOR2165 によって賄われています。
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
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