Un modello avanzato di murine per la steatoepatite non alcolica in associazione con il diabete di tipo 2
Summary
È descritto un semplice e affidabile modello animale di roditore indotto dalla dieta per la steatoepatite non alcolica (NASH), ottenuto attraverso l’alloggiamento non SPF degli animali e la somministrazione di una dieta specifica ad alto contenuto di grassi. Descriviamo l’identificazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie epatiche e adiposo per ricapitolare le condizioni immunologiche umane esponendo i topi ai germi ambientali.
Abstract
L’obesità è associata a infiammazione cronica di basso grado e resistenza all’insulina, contribuendo ad una crescente prevalenza di malattie metaboliche croniche, come il diabete di tipo 2 e la steatoepatite non alcolica (NASH). Recenti ricerche hanno stabilito che le cellule immunitarie pro-infiammatorie infiltrano obesi tessuto adiposo ipertrofico e fegato. Data l’importanza emergente delle cellule immunitarie nel contesto dell’omeostasi metabolica, vi è la necessità critica di quantificare e caratterizzare la loro modificazione durante lo sviluppo del diabete di tipo 2 e NASH. Tuttavia, i modelli animali che inducono caratteristiche patofisiologiche tipiche della NASH umana sono scarsi.
In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i sottogruppi di cellule immunitarie isolati dal fegato e dal tessuto adiposo in un modello di topo affidabile di NASH, stabilito da topi con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) in condizioni non specifiche prive di patogeno (SPF) senza barriera per almeno sette settimane. Dimostriamo la manipolazione dei topi in condizioni non-SPF, la digestione dei tessuti e l’identificazione dei macrofagi, delle cellule Natural Killer (NK), delle cellule dendritiche, dei sottogruppi di cellule B e T mediante citometria a flusso. Sono forniti diagrammi di citometria a flusso rappresentativo da topi HFD SPF e topi non SPF. Per ottenere dati affidabili e interpretabili, l’uso di anticorpi, metodi precisi e precisi per la digestione dei tessuti e la corretta gating negli esperimenti di citometria a flusso sono elementi critici.
L’intervento per ripristinare l’esposizione fisiologica di antigene nei topi che li ospita in condizioni non-SPF e l’esposizione non specifica agli antigeni microbici potrebbe fornire uno strumento pertinente per indagare il legame tra alterazioni immunologiche, l’obesità e le correlate complicazioni a lungo termine.
Introduction
L’obesità è un disturbo multifattoriale e un importante fattore di rischio per lo sviluppo di malattie cardiache, ictus, steatoepatite non alcolica (NASH), diabete di tipo 2 (T2D) e alcuni tipi di cancro. La prevalenza dell’obesità è in rapida crescita a livello globale. Oggi, 2,1 miliardi persone — quasi il 30% della popolazione mondiale — sono obesi o sovrappeso1. La resistenza all’insulina associata all’obesità può portare a T2D, quando le cellule beta dell’isolotto pancreatica esaurite non riescono a compensare l’aumentata necessità di insulina per mantenere l’omeostasi del glucosio2.
Tessuto adiposo è composto da vari tipi di cellule tra cui adipociti, cellule endoteliali, fibroblasti e cellule immunitarie. Durante la progressione dell’obesità, i cambiamenti nel numero e nell’attività delle cellule immunitarie possono portare a un’infiammazione di basso grado del tessuto adiposo ipertrofico3,4. In particolare, è stato riscontrato che l’eccessiva assunzione di energia, accompagnata da livelli cronicamente elevati di glucosio nel sangue, trigliceridi e acidi grassi liberi, porta ad ipossia adipociti, stress del reticolo endoplasmatico, compromissione della funzione mitocondriale e secrezione di citochine potenziata, con conseguente attivazione di cellule immunitarie adiposo pro-infiammatorie5,6. La ricerca passata si è concentrata principalmente sull’immunità innata, ma più recentemente le cellule immunitarie adattative (cellule T e B) sono emerse come importanti regolatori dell’omeostasi del glucosio. Possiedono cellule infiammatorie (tra cui CD8+ t, Th1 e B) o principalmente funzioni regolatorie (comprese le cellule t (Treg) regolatorie, cellule Th2) e possono sia esacerbare che proteggere contro l’insulino-resistenza7,8 , 9. il
Inoltre, sono stati proposti diversi meccanismi per spiegare come l’obesità aumenti la steatoepatite, inclusa l’aumento della produzione di citochines da parte del tessuto adiposo10. NASH, la forma progressiva di malattia epatica grassa non alcolica e un importante onere sanitario nei paesi sviluppati, è istologicamente caratterizzata da epatociti con pallino, accumulo lipidico, fibrosi e infiammazione pericellulare e può progredire verso malattia epatica in stadio terminale o carcinoma epatocellulare. Diversi regimi (ad esempio la metionina e la dieta carente di colina11) sono noti per indurre la patologia epatica simile a Nash in modelli animali non umani, ma la maggior parte di questi approcci non ricapitolano le condizioni umane di Nash e il suo metabolismo metabolico conseguenze in quanto richiedono un gene knockout specifico, manipolazioni dietetiche non fisiologiche o mancanza di insulino-resistenza tipica della NASH umana. Inoltre, la nostra comprensione dei meccanismi di base delle malattie metaboliche è attualmente basata su esperimenti condotti con topi di laboratorio alloggiati in condizioni specifiche esenti da patogeno (SPF) standard. Tali strutture di barriera sono anormalmente igieniche e non considerano la diversità microbica che gli esseri umani devono incontrare, il che può tenere conto delle difficoltà nel processo di traduzione degli studi sugli animali agli approcci clinici12,13 , ( 14).
Per indagare i diversi sottogruppi di cellule immunitarie nel tessuto adiposo e nel fegato durante lo sviluppo di resistenza all’insulina e NASH in un modello di topo avanzato che riproduce le condizioni immunologiche umane, i topi sono stati alloggiati in singole gabbie in semi sterili condizioni senza barriere. I topi alloggiati in condizioni di antigene esposto hanno sviluppato una patologia epatica simile a NASH già dopo 15 settimane di alimentazione ad alto contenuto di grassi (HFD)13. Rispetto ai topi SPF abbinati all’età hanno sviluppato steatosi macrovesicolare, infiltrazione epatica e attivazione delle cellule immunitarie.
Questo manoscritto descrive una solida analisi della citometria a flusso per definire e contare i sottogruppi delle cellule immunitarie dal tessuto adiposo del topo e dal fegato in un modello di NASH. L’analisi della citometria a flusso consente il rilevamento simultaneo di più parametri di singole cellule in contrasto con gli approcci RT-PCR o immunoistochimica.
In sintesi, il nostro studio offre un modello di topo di HFD a breve termine per indagare lo sviluppo di insulino-resistenza e NASH e i meccanismi di base che mostra anche la fedeltà alla condizione umana.
Protocol
Representative Results
Discussion
La steatoepatite ha una forte associazione con anomalie metaboliche come l’obesità, l’insulino-resistenza e la dislipidemia15. Studi multipli indicano che l’infiammazione del tessuto adiposo può guidare la patogenesi del diabete di tipo 2, compresi i livelli alterati di cellule del sistema immunitario innato e adattivo4,5,16,17 . Inoltre, è stato trovato che l’obesit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo anke Giuch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann per l’assistenza con le procedure sperimentali e Benjamin Tiburzy di Biolegend per commenti utili sulla strategia di gating. La JS è stata sostenuta dall’Helmholtz Grant (ICEMED). Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dall’unità di ricerca clinica del Berlin Institute of Health (BIH), il “BCRT-Grant” dal Ministero federale tedesco per l’istruzione e la ricerca e la Fondazione Einstein. K.S.-B. e H.-D.V. sono finanziati da FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
