نموذج Murine متقدم للتهاب الكبد غير الكحولية بالتعاون مع مرض السكري من النوع 2
Summary
ويوصف نموذج الحيوانية القوارض التي يسببها النظام الغذائي بسيطه وموثوق بها للتهاب الكبد غير الكحولية (ناش) ، يتحقق من خلال الإسكان غير SPF من الماشية وأداره نظام غذائي محدد عاليه الدسم. ونحن نوضح تحديد الخلايا المناعية الكبدية والدهنية لتلخيص الظروف المناعية البشرية من خلال تعريض الفئران للجراثيم البيئية.
Abstract
ترتبط السمنة بالتهابات المزمنة منخفضه الدرجة ومقاومه الانسولين ، مما يساهم في زيادة انتشار الامراض الايضيه المزمنة ، مثل مرض السكري من النوع 2 والتهاب الكبد غير الكحولي (ناش). وقد إنشات الأبحاث الاخيره ان الخلايا المناعية الموالية للالتهابات التسلل السمنة المفرطة الانسجه الدهنية والكبد. النظر إلى الاهميه الناشئة للخلايا المناعية في سياق التوازن الأيضي ، هناك حاجه ماسه لقياس وتوصيف تعديلاتها اثناء تطور مرض السكري من النوع 2 و ناش. ومع ذلك ، النماذج الحيوانية التي تحفز الميزات الفسيولوجية نموذجيه من ناش الإنسان متناثرة.
في هذه المقالة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتحديد مجموعات الخلايا المناعية المعزولة من الكبد والانسجه الدهنية في نموذج الماوس موثوق بها من ناش ، التي انشاتها السكن حمية عاليه الدسم (HFD) الفئران تحت ظروف غير محدده خاليه من العوامل الممرضة (SPF) دون حاجز لمده سبعه أسابيع علي الأقل. ونحن نظهر التعامل مع الفئران في ظروف غير SPF ، والهضم من الانسجه وتحديد الضامة ، القاتل الطبيعي (NK) الخلايا ، الخلايا الجذعية ، B و T الخلايا الفرعية من خلال تدفق الخلوية. يتم توفير مخططات التدفق الخلوي التمثيلي من الفئران SPF HFD والفئران غير SPF. للحصول علي بيانات موثوقه والتفسيره ، فان استخدام الأجسام المضادة ، والطرق الدقيقة والدقيقة لهضم الانسجه والنابضة السليمة في تجارب قياس التدفق الخلوي هي عناصر حاسمه.
التدخل لاستعاده التعرض مستضد الفسيولوجية في الفئران عن طريق السكن لهم في ظروف غير SPF والتعرض غير محدده للمستضدات الميكروبية يمكن ان توفر أداه ذات صله للتحقيق في الصلة بين التعديلات المناعية ، التي يسببها النظام الغذائي السمنة والمضاعفات ذات الصلة علي المدى الطويل.
Introduction
السمنة هي اضطراب متعدد العوامل وعامل خطر رئيسي للاصابه بامراض القلب ، والسكتة الدماغية ، والتهاب الكبد غير الكحولي (ناش) ، ومرض السكري من النوع 2 (T2D) وبعض أنواع السرطان. ويتزايد انتشار السمنة بسرعة علي الصعيد العالمي. واليوم ، 2,100,000,000 شخصا-اي ما يقارب 30% من سكان العالم-يعانون من السمنة المفرطة أو الوزن الزائد1. يمكن ان تؤدي مقاومه الانسولين المرتبطة بالسمنة إلى T2D ، عندما تفشل خلايا بيتا البنكرياس المستنفدة لتعويض الحاجة المتزايدة للانسولين للحفاظ علي التوازن الجلوكوز2.
تتكون الانسجه الدهنية من أنواع مختلفه من الخلايا بما في ذلك الخلايا الشحمية والبطانات الليفية والخلايا المناعية. اثناء تطور السمنة ، يمكن ان تؤدي التغيرات في عدد ونشاط الخلايا المناعية إلى التهاب منخفض الدرجة من الانسجه الدهنية التضخمية3،4. علي وجه التحديد, وقد وجد ان الإفراط في استهلاك الطاقة, يرافقه مستويات مرتفعه بشكل مزمن من الجلوكوز في الدم, الدهون الثلاثية والأحماض الدهنية الحرة, يؤدي إلى نقص الأكسجين الشحمي, الإجهاد الشبكي إندوبلازمي, ضعف وظيفة الميتوكوندريا إفراز السايسيسيني المعزز ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا المناعية الدهنية الموالية للالتهابات5،6. ركزت الأبحاث السابقة أساسا علي المناعة الفطرية ، ولكن الخلايا المناعية المتكيفة مؤخرا (خلايا T و B) برزت كمنظمين مهمين لتوازن الجلوكوز. انها تمتلك التهابات ( بما في ذلك خلايا CD8 + t ، Th1 ، والخلايا B) أو الوظائف التنظيمية في المقام الأول (بما في ذلك الخلايا t (treg) التنظيمية ، Th2 الخلايا) ويمكن ان تؤدي إلى تفاقم أو حماية ضد مقاومه الانسولين7،8 , 9-الآن
وعلاوة علي ذلك ، اقترحت عده أليات لشرح كيفيه زيادة السمنة التهاب الكبد ، بما في ذلك زيادة إنتاج السايتوكينات بالانسجه الدهنية10. ناش ، الشكل التقدمي لمرض الكبد الدهني غير الكحولية والعبء الصحي الرئيسي في البلدان المتقدمة ، ويتميز نسيجيا بخلايا الكبد المتضخمة ، وتراكم الدهون ، والتليف والتهاب بيريسيلولار وقد تقدم تليف الكبد ، والمرحلة الاخيره من مرض كبدي أو سرطان الخلايا الكبدية. نظام العديد من (علي سبيل المثال ميثيونين والكولين نقص النظام الغذائي11) ومن المعروف للحث علي الامراض الكبدية مثل ناش في نماذج الحيوانية غير البشرية, ولكن معظم هذه النهج لا تلخص الظروف البشرية ناش والايضيه لها العواقب لأنها اما تتطلب محدده الجينات الضربة القاضية, التلاعب الغذائية غير الفسيولوجية أو عدم وجود مقاومه الانسولين نموذجيه من ناش الإنسان. وعلاوة علي ذلك ، فان فهمنا للأليات الاساسيه للامراض الايضيه يقوم حاليا علي التجارب التي أجريت مع فئران المختبرات الموجودة تحت ظروف المرض الخاصة الخالية من العوامل الممرضة (SPF). ان عائقه تسهيلات بشكل غير طبيعي صحية ولا يعتبر التنوع جرثوميه أناس سوفت تلاقيت, اي يمكن سببت صعوبات في الترجمة عمليه من دراسات حيوانيه إلى مقاربه سريريه12,13 , أربعه عشر
للتحقيق في مختلف الخلايا المناعية الفرعية في الانسجه الدهنية والكبد خلال تطوير مقاومه الانسولين و ناش في نموذج الماوس المتقدمة استنساخ الظروف المناعية البشرية ، وكانت الفئران التي تقع في أقفاص الفردية في شبه معقمه ظروف دون حاجز. الفئران التي تقع تحت مستضد الظروف المعرضة وضعت ناش مثل علم الامراض الكبد بالفعل بعد 15 أسابيع من الحمية الغذائية عاليه الدسم (HFD) التغذية13. بالمقارنة مع الفئران المتطابقة مع العمر SPF انها وضعت steatosis فوق الترقوة ، تسلل الكبد وتنشيط الخلايا المناعية.
تصف هذه المخطوطة تحليلا قويا لقياس التدفق الخلوي لتحديد وحساب مجموعات الخلايا المناعية من الانسجه الدهنية للماوس والكبد في نموذج من ناش. تحليل تدفق الخلوي يسمح الكشف عن المعلمات متعددة من الخلايا الفردية في وقت واحد علي النقيض من RT-PCR أو مناعي النهج.
وباختصار ، تقدم دراستنا نموذج الماوس لفتره قصيرة HFD للتحقيق في تطور مقاومه الانسولين و ناش واليات الكامنة التي تظهر أيضا الإخلاص للحالة البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التهاب الكبد الدهني له علاقة قويه مع تشوات الأيض مثل السمنة ، ومقاومه الانسولين وعسر الدهون15. تشير الدراسات المتعددة إلى ان التهاب الانسجه الدهنية يمكن ان يدفع التسبب في مرض السكري من النوع 2 ، بما في ذلك مستويات الخلايا المتغيرة لكل من الجهاز المناعي الفطري والمتكيف<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Anke جوريتش ، ديانا Woellner ، الدكتور Kathrin ويت و كورنيليا هيكمان للحصول علي المساعدة في الإجراءات التجريبية وبنيامين تيكاتزي من Biolegend للحصول علي تعليقات مفيده علي استراتيجية النابضة. تم دعم J.S. من قبل المنحة هيلهولتز (ICEMED). وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من وحده البحوث الاكلينيكيه التابعة لمعهد برلين للصحة ، و “منحه BCRT” التي قدمتها وزاره التعليم والبحوث الاتحادية المانيه ومؤسسه اينشتاين. K.S.-B. و D.V. مموله من قبل FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
