Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi
Summary
Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak fonksiyonel sinaptik çeşitlilik değerlendirmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Merkezi sinir sistemi nöronlar bir çift sık sık birden çok sinaptik kişiler ve/veya fonksiyonel nörotransmitter yayın siteleri (sinaptik çeşitlilik) oluşturur. Sinaptik plastik ve değişiklikler geliştirme boyunca ve sinaptik iletimi etkinliği için önemli bir belirleyici olmak farklı fizyolojik koşullarda olduğunu. Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak belirli bir postsinaptik nöron üzerine sonlandırma sinapslarda çokluğu derecesini tahmin etmek için deneyler anahat. Özellikle, Gerilim Tipi Kelepçe kayıt spontan eksitatör postsinaptik akımları (sEPSCs) genliği ve minyatür eksitatör postsinaptik akımları (mEPSCs) arasında fark karşılaştırmak için kullanılır. Bu yöntem arkasında çeşitlilik gösteren afferent girişleri her sinaptik temas oluşur zaman uyumlu sürümü nedeniyle büyük, Aksiyon potansiyeli bağımlı sEPSCs gösterecektir teoridir. Buna ek olarak, (zaman uyumsuz olan) aksiyon potansiyeli bağımsız yayın daha küçük genlik mEPSCs oluşturur. Bu makalede birtakım deneyler ve analizler sinaptik çeşitlilik varlığını karakterize için özetliyor ve teknik sınırlamaları ve gereksinimleri verilmektedir. Bu teknik vivo etkiler sinaptik kişiler farklı beyin bölgeleri’organizasyonu nasıl farklı davranış, farmakolojik ya da çevresel müdahaleleri araştırmak için uygulanabilir.
Introduction
Sinaptik iletimi nöronlar arasındaki iletişim için temel bir mekanizmadır ve dolayısıyla, beyin işlev. Sinaptik iletimi aynı zamanda değişken ve onun etkinliğini de yanıt düzenleyici sinyaller1gibi bir etkinlik bağlı şekilde değiştirebilirsiniz. Böylece, sinaptik fonksiyon incelenmesi nörolojik araştırma anahtar bir odağı olmuştur. Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji anlamak, tasarlayarak Deneysel Tasarımlar ve veri analizleri, derinlemesine biyofiziksel ve moleküler mekanizmaları sinaptik iletimi için bize sağlar çok yönlü bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, belki teknik ve kavramı sayesinde, minyatür eksitatör/inhibitör postsinaptik akımların ölçülmesi basitliğidir (bana / IPSCs) gerilim altında yapılandırma2,3, kelepçe 4 , 5 , 6. bireysel ÇATOM presynaptic terminalden 7 serbest bırakmak onların anılan sıraya göre nörotransmitter bağlama cevaben iyonlar aracılığıyla postsinaptik ionotropic reseptörleri (örneğin AMPA ve GABAA reseptörleri) akışını temsil . Kayıt voltaj Na+ kanal engelleyici Tetradotoksin varlığında (TTX) elde edilir çünkü serbest aksiyon potansiyeli bağımsızdır ve normalde nörotransmitter içeren tek bir sinaptik vezikül içerir. Bu duymadığını, ÇATOM ortalama genliği yaygın sayı ve bir tek yayın sitesi karşı postsinaptik reseptörleri işlevini temsil eden quantal boyutu için kaba bir tahmin olarak kullanılır. Öte yandan, ÇATOM sıklığını postsinaptik hücre ve onların ortalama yayın olasılık üzerine sonlandırma sinapslarda toplam sayısı bir arada temsil etmek için kabul edilir. Ancak, bu parametreler başka bir değişken-multiplicativity sinapslar veya sinaptik çeşitlilik ölçüyor musunuz — hangisi sinaptik iletimi etkinliği için önemli.
Sinaptik iletimi7,8,9quantal teorisi üzerinde bağlı olarak, bir çift nöronların arasında belirli bir bağlantı gücü üç faktöre bağlıdır: fonksiyonel sinapslarda (N) sayısı postsinaptik yanıt-e doğru serbest bırakmak-in tek sinaptik vezikül (quantal boyutu; Q) ve nörotransmitter yayın (Pr) olasılığı. Sinaptik çeşitlilik Niçin eşdeğerdir. Sinaptik çeşitlilik geliştirilmesi veya çarpma sinapslarda budama boyunca geliştirme ve farklı hastalık Birleşik3,4,6,10plastiktir. Bu nedenle, sinaptik çeşitlilik karakterize sağlık ve hastalığında sinaptik iletimi etkinliğini anlamak için önemli sonuçları vardır. Elektron mikroskobu gibi teknikleri sinaptik çeşitlilik yapısal kanıtı aynı postsinaptik nöron11,12üzerine aynı axon kaynaklanan birden fazla sinaptik kişi tespit ederek belirleyebilir, 13,14. Ancak, bu yapısal olarak tanımlanan multisynapses işlevsel olarak sessiz15,16olabilir. N kesin fonksiyonel inceleme gerektirir teknik olarak Elektrofizyolojik yaklaşımlar, belirli bir bağlantı birden çok fonksiyonel yayın siteleri olup olmadığını belirleyebilir eşleştirilmiş bütün hücreli kayıtları gibi zorlu ve en az tek bir sözde axon işe hedefliyoruz stimülasyon yaklaşımlar.
Bu protokol için başlangıçta Hsia ark2tarafından geliştirilmiş bir yöntem benimseyerek sinaptik çeşitlilik tahmin etmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik kendiliğinden PSC’ler (sPSCs) ve belirli bir neuron için tüm girişleri arasında sinaptik çeşitlilik derecesini tahmin etmek için bize izin verir tüm hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak ÇATOM ölçümü içerir. Gibi önceden tanımlanmış, sinaptik çeşitlilik belirli bir öncesi ve postsinaptik nöron arasındaki sinapslar sayısını yansıtır. Birden çok sinapslarda senkronizasyonu içinde bir aksiyon potansiyeli tarafından işe, büyük genlik PSC üreten bireysel (yani quantal) PSC zamansal toplamı yüksek bir olasılık olacak. ÇATOM kayıtları (hangi aksiyon potansiyelleri TTX tarafından engellenen), geçici bireysel (zaman uyumlu) ÇATOM toplamı olasılığı düşüktür. Bu mantığı kullanarak, sinaptik çeşitlilik (Aksiyon potansiyeli bağımlı sürümüyle) sPSC genlik ÇATOM genlik için karşılaştırarak tahmin edilebilir.
Çeşitlilik varlığını incelemek için dört deneyleri ve onların analizleri glutamatergic EPSCs örnek olarak kullanarak açıklar. Ancak, aynı yaklaşımı-ebilmek var olmak kullanılmış için hızlı GABAergic/glycinergic iletim (IPSCs). Her deneme için kısa bir gerekçe aşağıda açıklanmıştır. İlk olarak, yukarıda açıklandığı gibi sinaptik çeşitlilik sEPSCs mEPSCs için genliği karşılaştırarak tahmin edilebilir. Bu yaklaşım için iki gereksinim vardır; 1) presynaptic akson kayıt sırasında aksiyon potansiyelleri yeterli sayıda yangın gerekir ve böylece birden çok sinapslarda sinir bir aksiyon potansiyeli girişte yayın 2) Pr yüksek olmalıdır. Bu gereksinimleri karşılamak üzere, sEPSCs ilk düşük Ca2 + yapay serebrospinal sıvı (aCSF) kaydedilir ve düşük konsantrasyon K+ kanal antagonisti, 4-eylem artırmak için Aminopyridine (4-AP) huzurunda kaydedildi potansiyel ateş ve Pr. O zaman aksiyon potansiyeli ateş TTX ve Pr bir voltaj Ca2 + kanal engelleyici tarafından Cd2 +azalmış tarafından engellendi. SEPSCs (4AP ile) genliği bu mEPSC karşılaştırılır (4AP, TTX ve Cd2 +). İkinci denemede Ca2 + ekimolar Sr2 + vezikül yayın desynchronize aCSF olarak değiştirilir. CA2 + veziküller zaman uyumlu sürümü için gerekli olduğu gibi değiştirme ile Sr2 + çokluğu işaret etmektedir büyük genlik sEPSCs ortadan kaldırmak gerekir. Üçüncü olarak, mechanistically, çeşitlilik birden çok sinaptik ilgili kişiler aynı postsinaptik nöron veya multivesicular açıklaması (içinde tek bir sinaptik kişiyi serbest Yani çoklu veziküller) neden olabilir17,18. Çeşitlilik iki tür arasında ayırt etmek için üçüncü deneme kullandığı bir düşük benzeşme, hızlı dissociating rekabetçi antagonist AMPA reseptör, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,büyük olup olmadığını belirlemek için18 sEPSC multivesicular serbest postsinaptik reseptörleri örtüşen bir popülasyon üzerinde hareket veya bağımsız sinapslarda zamansal özetleme sonucudur. Büyük genlik olayları multivesicular yayınlamasını ortaya çıkarsa, birden fazla sinaptik kişi zamansal toplamı ortaya büyük sEPSCs benzer şekilde etkilenecek ise γ-DGG büyük kıyasla daha küçük sEPSCs, engelleme daha az etkili olacak γ-DGG. Dördüncü denemede daha fizyolojik bir yöntem aksiyon potansiyeli ateş, yani afferent sinaptik uyarma arttırmak için kullanılır. Sinirsel aktivite patlamaları geçici artış/uyarılan afferents spontan aksiyon potansiyeli ateş ve yayın olasılığını kolaylaştırabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım daha fizyolojik bir şekilde tezahür etmeye çeşitlilik sağlar.
Aşağıdaki iletişim kuralı bu deneyler fare hipotalamik doku yöntemler açıklanmıştır. Özellikle, kortikotropin serbest hormon (İBB) nöronlar hipotalamus (PVN) paraventricular çekirdeği kullanılır. Biz bütün hücreli yama kelepçe Elektrofizyoloji yürütmek için yordamlar açıklar ve sinaptik çeşitlilik için test etmek için belirli deneyler açıklamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı yama kelepçe Elektrofizyoloji deneme için bir önemli şart sağlıklı dilimleri/hücre almaktır. Bizim açıklanan protokol PVN nöronlar içeren hipotalamik dilimler için optimize edilmiştir. Diğer beyin alanları gerektirebilir çözümleri ve dilimleme yöntemleri21,22,23,24değiştiren. Kayıt için yalnızca hücre özellikleri membran direnç gibi sürekli izleyerek is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JS Ontario lisansüstü öğrenim bursu aldım. W.I. zihinsel sağlık araştırma Kanada’dan yeni bir araştırmacı bursu aldı. Bu eser hibe W.I için Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (06106-2015 RGPIN) ve Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (PJT 148707) tarafından desteklenen işletim.
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
- Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
- Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
- Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
- Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
- Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
- van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
- Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
- Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
- Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
- Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
- Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
- Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
- Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
- Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
- Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
