Оценка синаптических кратности, используя поклеточного патч зажим электрофизиологии

Синаптической передачи является основным механизмом для связи между нейронами и следовательно, мозга функции. Синаптической передачи также лабильных и может изменить его эффективности на основе зависящих от деятельности, а также ответ модулирующее сигналы¹. Таким образом рассмотрение синаптического функция был ключевым направлением исследований неврологии. Патч поклеточного зажим электрофизиологии — это универсальный метод, который позволяет нам понять, разработки экспериментальных проектов и анализ данных, углубленные биофизические и молекулярные механизмы синаптической передачи. Часто используемый подход, возможно благодаря простоте технику и концепции, является измерение миниатюрные возбуждающим/тормозной постсинаптический токов (mE / IPSCs) под напряжением зажим конфигурации^{2,3, 4 , 5 , 6}. отдельные mPSCs представляют поток ионов через ИОНОТРОПНЫХ постсинаптических рецепторов (например, АМПА и ГАМК-_А рецепторов) в ответ на привязку их соответствующих нейротрансмиттеров, выпустила Пресинаптический терминала ⁷ . Поскольку запись получается при наличии напряжения закрытый Na⁺ канала блокатор Тетродотоксин (TTX), потенциал действия независимые и выпуска обычно включает один синаптических пузырьков, содержащий нейромедиатора. Основываясь на этом предположении, средняя амплитуда mPSCs широко используется как сырой смету для квантильного размер, который представляет количество и функциональность постсинаптических рецепторов, против сайта сингл. С другой стороны частота mPSCs, как считается, представляют собой сочетание общего числа синапсов, прекращения на постсинаптической клетке и вероятность их средняя выпуска. Однако, эти параметры не измеряют другой переменной мультипликативность синапсы, или синаптических кратности, которая имеет важное значение для эффективности синаптической передачи.

Основываясь на квантильного теории синаптической передачи^7,8,9, сила данного соединения между парой нейронов зависит от трех факторов: количество функциональных синапсов (N), постсинаптического ответа на выпуск одного синаптических пузырьков (квантовый размер; Q) и вероятность нейромедиатора релиз (P-_r). Синаптических кратности эквивалентен N. Развитию синаптических кратности или обрезка мультипликативной синапсы — пластик на протяжении развития и различные болезни государства^3,4,6,10. По этой причине характеризующие синаптических кратность имеет важные последствия для понимания эффективности синаптической передачи в здоровье и болезни. Методы, такие как электронная микроскопия можно определить структурные доказательства синаптических кратности, обнаружение нескольких синаптических контактов, возникая от же аксон на же постсинаптических нейронов^{11,12, 13,14}. Однако эти структурно определенных multisynapses может быть функционально немого^15,16. Точное функциональные обследования N требует технически сложных электрофизиологических подходы, такие как парные поклеточного записей, которые можно определить ли данного соединения имеет несколько функциональных релиз сайтов и минимальным стимуляция подходы, которые стремятся нанимать одного предполагаемого аксон.

В этом протоколе мы опишем простой метод для оценки синаптических кратности, приняв метод, первоначально разработанный Hsia et al². Этот метод предполагает измерение спонтанного Чок (sPSCs) и mPSCs с помощью зажима электрофизиологии поклеточного патч, который позволяет нам оценить степень синаптических многообразие во всех материалов для данного нейрона.  Как ранее определенных, синаптических кратности отражает количество синапсов между данной предварительной и постсинаптических нейрона. Если несколько синапсы набираются в синхронности действий потенциал, будет высокой вероятностью височной суммирование отдельных (т.е. квантильного) Чок, создавая большую амплитуду PSC.  В записях mPSC (в котором потенциалы действия блокируются TTX), низка вероятность временной суммирование отдельных (не синхронный) mPSCs. Используя это обоснование, синаптических кратность можно оценить путем сравнения амплитуды СКТУ (с релиз действий потенциал зависимых) mPSC амплитуде.

Чтобы проверить существование множества мы описываем четырех экспериментов и их анализа с использованием глутаматергические EPSCs качестве примера. Однако, такой же подход может использоваться для быстрой передачи ГАМК/glycinergic (IPSCs). Ниже приводится краткое обоснование каждого эксперимента. Во-первых как объяснялось выше, синаптических кратность можно оценить путем сравнения амплитуды sEPSCs к mEPSCs. Существуют два требования для этого подхода; 1) Пресинаптический аксоны должен стрелять достаточное количество потенциалы действия во время записи, и 2) P_r должны быть высокой, так что несколько синапсы освобождение нейромедиатора по прибытии потенциал действия. Чтобы соответствовать этим требованиям, sEPSCs сначала записываются в низкой Ca^{2 +} искусственный спинномозговой жидкости (ФАГО) и затем записал присутствии низкой концентрации антагонистов канал K⁺ , 4-Aminopyridine (4-AP) для увеличения действий P_rи потенциальные увольнения. Затем огонь потенциал действия заблокирован TTX и Pr, снизился на закрытом напряжения Ca^{2 +} канала блокатор Cd^{2 +}. Амплитуда sEPSCs (с 4AP) по сравнению с mEPSC (с 4AP, TTX и Cd^{2 +}). Во втором эксперименте Ca^{2 +} заменяется эквимолярных Sr^{2 +} в фаго десинхронизироваться везикул выпуска. Как Ca^{2 +} требуется для синхронный выпуске везикулы, замена с Sr^{2 +} следует устранить sEPSCs большой амплитуды, которая свидетельствует о множественности. В-третьих, механически, многообразие может быть результатом либо несколько синаптических контактов же постсинаптических нейронов или multivesicular выпуска (то есть несколько везикулы, выпущенные в течение одного синаптического контакта)^17,18. Проводить различие между двумя типами кратности, третий эксперимент использует низкого сродства, быстро разъединять конкурентным антагонистом рецепторов АМПА, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 , чтобы определить, является ли большой sEPSC являются результатом временной суммирование независимых синапсов или multivesicular релиз, действуя на перекрывающихся населения постсинаптических рецепторов. Если большой амплитуды события вытекают из multivesicular выпуска, γ-DGG будет менее эффективным в ингибирующих больше по сравнению с небольших sEPSCs, тогда как большой sEPSCs, которые возникают от височной суммирование нескольких синаптических контактов будут аналогичным образом затронуты Γ-DGG. В четвертом эксперимент более физиологический метод используется для повысить потенциал действия стрельбы, а именно афферентных синаптических стимуляции. Всплесков синаптической активности может временно увеличить/облегчить самопроизвольно потенциал действия стрельбы и выпуска вероятность стимулировали афферентов. Таким образом этот подход позволяет кратности проявляться в более физиологическим способом.

Следующий протокол описывает метод для проведения этих экспериментов в мыши гипоталамуса ткани. В частности используются АКТГ выпуская инкреть (ЦРБ) нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВН). Мы описывать процедуры для проведения поклеточного патч зажим электрофизиологии и объяснить конкретные эксперименты для проверки синаптических кратности.