Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

Trasmissione sinaptica è un meccanismo fondamentale per la comunicazione tra neuroni e quindi, funzione cerebrale. Trasmissione sinaptica anche è labile e può cambiare la sua efficacia in maniera dipendente di attività anche come in risposta a segnali modulatoria¹. Così, esaminando funzione sinaptica è stato dei principali obiettivi di ricerca in neuroscienza. Elettrofisiologia di cellule intere patch clamp è una tecnica versatile che permette di comprendere, di elaborare disegni sperimentali e analisi dei dati, approfondite meccanismi biofisici e molecolari della trasmissione sinaptica. Un approccio comunemente utilizzato, forse a causa della semplicità del concetto e tecnica, è la misura delle correnti postsinaptico eccitatorio/inibitorio in miniatura (mE / IPSCs) nell’ambito della tensione morsetto configurazione^{2,3, 4 , 5 , 6}. mPSCs individuali rappresentano il flusso di ioni attraverso recettori ionotropici postsinaptici (ad es. recettori AMPA e GABA_A ) in risposta all’associazione dei loro rispettivi neurotrasmettitori rilasciati dal terminale presinaptico ⁷ . Perché la registrazione si ottiene in presenza della tensione-gated Na⁺ canale bloccanti della tetrodotossina (TTX), l’uscita è indipendente dal potenziale d’azione e prevede normalmente una singolo delle vescicole sinaptiche che contiene del neurotrasmettitore. Basato su questo presupposto, l’ampiezza media di mPSCs è ampiamente usato come una stima grezza per la dimensione quantal, che rappresenta il numero e la funzionalità dei recettori postsinaptici opposte di un singolo sito. D’altra parte, la frequenza di mPSCs è considerata di rappresentare una combinazione del numero totale delle sinapsi che chiude sulla cellula postsinaptica e loro probabilità di rilascio medio. Tuttavia, questi parametri non misurare un’altra variabile-multiplicativity di sinapsi, o molteplicità sinaptica — che è importante per l’efficacia della trasmissione sinaptica.

Basato sulla teoria quantal della trasmissione sinaptica^7,8,9, la forza di una determinata connessione tra una coppia di neuroni è dipendente da tre fattori: il numero delle sinapsi funzionali (N), il risposta postsinaptica al rilascio di una singola vescicola sinaptica (quantal dimensione; Q) e la probabilità di rilascio di neurotrasmettitore (P_r). Sinaptica molteplicità equivale a N. Lo sviluppo di molteplicità sinaptica o la potatura delle sinapsi moltiplicative è plastica nel corso dello sviluppo e nella malattia diversi stati^3,4,6,10. Per questo motivo, che caratterizzano la molteplicità sinaptica ha implicazioni importanti per comprendere l’efficacia della trasmissione sinaptica nella salute e nella malattia. Tecniche, come il microscopio elettronico possono identificare prove strutturali di molteplicità sinaptica rilevando più contatti sinaptici provenienti dall’assone stesso sulla stesso neurone postsinaptico^{11,12, 13,14}. Tuttavia, questi multisynapses strutturalmente identificati possono essere funzionalmente silenzioso^15,16. Esame preciso funzionale di N richiede tecnicamente impegnativi approcci elettrofisiologici, come accoppiati registrazioni della intero-cellula che possono identificare se una determinata connessione dispone di più siti di rilascio funzionale e minimale approcci di stimolazione che mirano a reclutare un singolo assone putativo.

In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per stimare la molteplicità sinaptica adottando un metodo sviluppato originariamente da Hsia et al². Questa tecnica prevede la misura di spontanea PSC (sPSCs) e mPSCs usando cellule intere patch clamp ed elettrofisiologia, che ci permette di stimare il grado di molteplicità sinaptica attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone.  Come definito in precedenza, sinaptica molteplicità riflette il numero di sinapsi tra un dato neurone pre- e postsinaptico. Se più sinapsi sono reclutate in sincronia di un potenziale di azione, ci sarà un’alta probabilità di temporale sommatoria di singoli sportelli unici (cioè quantali), generando una maggior ampiezza PSC.  Nelle registrazioni mPSC (in cui i potenziali di azione sono bloccati da TTX), la probabilità di temporale sommatoria di singoli mPSCs (asincrono) è bassa. Utilizzando questa logica, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l’ampiezza sPSC (con rilascio di potenziale di azione-dipendente) per l’ampiezza di mPSC.

Per esaminare l’esistenza di molteplicità Descriviamo quattro esperimenti e loro analisi utilizzando glutamatergic EPSC come esempio. Tuttavia, lo stesso approccio può essere utilizzato per la veloce trasmissione GABAergica/glycinergic (IPSCs). Una breve spiegazione razionale per ogni esperimento è descritto di seguito. In primo luogo, come spiegato sopra, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l’ampiezza del sEPSC a mIPSCs. Ci sono due requisiti per questo approccio; 1) presinaptici assoni devono sparare un numero sufficiente di potenziali d’azione durante la registrazione, e 2) P_r deve essere alta in modo che le sinapsi più rilasciare neurotrasmettitore dopo l’arrivo del potenziale d’azione. Per soddisfare questi requisiti, sEPSC sono per la prima volta in basso Ca^{2 +} artificiale del liquido cerebrospinale (aCSF) e poi registrato in presenza di una bassa concentrazione dell’antagonista canale K⁺ , 4-aminopiridina (4-AP) per aumentare l’azione infornamento potenziale e P_r. Quindi di infornamento del potenziale di azione è bloccato da TTX e Pr sono diminuite di una tensione-gated Ca^{2 +} antagonista Cd^{2 +}. L’ampiezza del sEPSC (con 4AP) è paragonato a quello di mEPSC (con 4AP, TTX e Cd^{2 +}). Nel secondo esperimento, Ca^{2 +} è sostituito da equimolare Sr^{2 +} in aCSF a desincronizzarsi rilascio vescicola. Come Ca^{2 +} è necessario per il rilascio sincrono delle vescicole, sostituzione con Sr^{2 +} dovrebbe eliminare il sEPSC di grande ampiezza che sono indicativi di molteplicità. In terzo luogo, meccanicistico, molteplicità può derivare da entrambi più contatti sinaptici alla stesso neurone postsinaptico o multivesicular rilascio (cioè più vescicole rilasciate all’interno di un singolo contatto sinaptico)^17,18. Per differenziare tra i due tipi di molteplicità, il terzo esperimento utilizza una bassa affinità, veloce dissociazione antagonista competitivo dei recettori AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 per determinare se grande sEPSC sono il risultato della somma temporale di sinapsi indipendente o multivesicular rilascio che agisce su una popolazione di sovrapposizione dei recettori postsinaptici. Se gli eventi di grande ampiezza derivano dalla release multivesicular, γ-DGG sarà meno efficace ad inibire più grande sEPSC rispetto ai più piccoli, mentre grandi sEPSC che derivano dalla sommatoria temporale dei contatti sinaptici multipli allo stesso modo saranno interessati da Γ-DGG. Nel quarto esperimento, un metodo più fisiologico viene utilizzato per migliorare il potenziale di azione sparando, vale a dire afferente stimolazione sinaptica. Scoppi di attività sinaptica possono transitoriamente aumento/facilitare la probabilità di infornamento e rilascio di potenziale di azione spontanea delle afferenze stimolata. Questo approccio permette quindi di molteplicità di manifestare in maniera più fisiologica.

Il seguente protocollo descrive il metodo per lo svolgimento di questi esperimenti nel tessuto ipotalamico del mouse. In particolare, corticotropina liberantesi ormone (CRH) neuroni del nucleo paraventricolare dell’ipotalamo (PVN) sono utilizzati. Descriviamo le procedure per lo svolgimento di elettrofisiologia di cellule intere patch clamp e spiegare gli esperimenti specifici per testare per molteplicità sinaptica.