Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

Synaptische transmissie is een fundamenteel mechanisme voor de communicatie tussen de neuronen, en vandaar, hersenfunctie. Synaptische transmissie is ook labiele en haar werkzaamheid in een activiteit-afhankelijke manier zo goed zoals in reactie op f signalen¹kunt wijzigen. Behandeling van synaptische functie is dus een belangrijke focus van het onderzoek neurowetenschap. Geheel-cel patch klem electrofysiologie is een veelzijdige techniek waarmee ons te begrijpen, bedenken experimentele designs en data-analyses, diepgaande biofysische en moleculaire mechanismen van synaptische transmissie. Een veel gebruikte aanpak, misschien vanwege de eenvoud van de techniek en concept, is het meten van miniatuur excitatory/remmende postsynaptisch stromen (mE / IPSCs) onder de spanning klem configuratie^{2,3, 4 , 5 , 6}. afzonderlijke mPSCs vertegenwoordigen de stroom van ionen via postsynaptisch ionotropic receptoren (bijvoorbeeld AMPA en GABA_A -receptoren) in reactie op de binding van hun respectieve neurotransmitters vrijgesteld van de presynaptische terminal ⁷ . Omdat de opname wordt verkregen in de aanwezigheid van de spanning-gated nb⁺ kanaal blocker tetrodotoxine (TTX), de release is actiepotentiaal-onafhankelijk en normaal impliceert een één synaptic blaasje met neurotransmitters. Op basis van deze veronderstelling, wordt de gemiddelde amplitude van de mPSCs veel gebruikt als een ruwe schatting voor de grootte van quantal, waarmee het aantal en de functionaliteit van postsynaptisch receptoren tegen een enkele release-site. Aan de andere kant, wordt de frequentie van de mPSCs geacht te vertegenwoordigen een combinatie van het totale aantal synapsen tot beëindiging op de postsynaptisch cel en de waarschijnlijkheid van hun gemiddelde release. Deze parameters meten echter niet een andere variabele-multiplicativity van synapsen of synaptic multipliciteit — dat is belangrijk voor de doeltreffendheid van synaptische transmissie.

Gebaseerd op de quantal theorie van synaptische transmissie^7,8,9, de sterkte van een bepaalde verbinding tussen twee neuronen is afhankelijk van drie factoren: het aantal functionele synapsen (N), de postsynaptisch reactie op de release van een enkele synaptic blaasje (quantal grootte; Q) en de waarschijnlijkheid van neurotransmitter release (P_r). Synaptic multipliciteit is gelijk aan N. De ontwikkeling van synaptic multipliciteit of de sanering van de multiplicatieve synapsen is kunststof in ontwikkeling en in andere ziekte staten^3,4,6,10. Om deze reden heeft karakteriseren van synaptic multipliciteit belangrijke implicaties voor het begrijpen van de werkzaamheid van synaptische transmissie bij gezondheid en ziekte. Technieken, zoals elektronenmicroscopie kunnen structurele bewijs van synaptic multipliciteit herkennen door het detecteren van meerdere synaptic contactpersonen die afkomstig zijn uit de dezelfde axon op de dezelfde postsynaptisch neuron^{11,12, 13,14}. Deze structureel geïdentificeerde multisynapses kunnen echter functioneel stille^15,16. Precieze functionele behandeling van N meebrengt dat technisch uitdagende elektrofysiologische benaderingen, zoals gepaarde geheel-cel opnames die vaststellen kunnen of een bepaalde verbinding meerdere functionele release sites heeft en minimale stimulatie benaderingen die gericht zijn op het werven van een enkele vermeende axon.

In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het schatten van synaptic multipliciteit door het aannemen van een methode die oorspronkelijk ontwikkeld door Hsia et al.². Deze techniek omvat het meten van de spontane PSC’s (sPSCs) en mPSCs met behulp van geheel-cel patch klem electrofysiologie, waardoor we de mate van synaptic multipliciteit schatten van alle ingangen naar een bepaalde neuron.  Zoals eerder omschreven, synaptic multipliciteit het aantal synapsen tussen een bepaalde pre-en postsynaptisch neuron geeft. Als meerdere synapsen worden gerekruteerd in synchronie door een actiepotentiaal, zal er een hoge waarschijnlijkheid van temporele sommatie van individuele (d.w.z. quantal) PSC, het genereren van een grotere amplitude PSC.  In mPSC-opnamen (in welke actie potentials worden geblokkeerd door TTX), de waarschijnlijkheid van temporele sommatie van afzonderlijke (niet-synchrone) mPSCs is laag. Met behulp van deze grondgedachte, kan synaptic multipliciteit worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sPSC (met actiepotentiaal-afhankelijke versie) met de amplitude van de mPSC.

Onderzoek naar het bestaan van multipliciteit beschrijven we vier experimenten en hun analyses met behulp van glutamaterge EPSCs als voorbeeld. Dezelfde aanpak kan echter worden gebruikt voor de snelle toezending van de GABAergic/glycinergic (IPSCs). Een korte motivering van elk experiment wordt hieronder beschreven. Eerst, zoals hierboven uitgelegd, synaptic multipliciteit kan worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sEPSCs te mEPSCs. Er zijn twee vereisten voor deze aanpak; 1) presynaptische axonen moeten een voldoende aantal actie potentials brand tijdens de opname, en 2) P_r moet hoog zijn, zodat meerdere synapsen release neurotransmitter bij binnenkomst van een actiepotentiaal. Om aan deze eisen voldoen, worden sEPSCs eerst geregistreerd in lage Ca^{2 +} kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), en vervolgens opgenomen in de aanwezigheid van een lage concentratie van de K⁺ kanaal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) toe actie potentiële afvuren en P_r. Actiepotentiaal afvuren wordt dan geblokkeerd door TTX en Pr daalde met een spanning-gated Ca^{2 +} kanaal blocker Cd^{2 +}. De amplitude van de sEPSCs (met 4AP) wordt vergeleken met die van mEPSC (met 4AP, TTX en Cd^{2 +}). In het tweede experiment, is Ca^{2 +} vervangen door mengsel Sr^{2 +} in de aCSF te desynchronize blaasje release. Als Ca^{2 +} vereist voor de synchrone release van blaasjes is, moet vervanging met Sr^{2 +} de grote amplitude-sEPSCs die indicatief voor multipliciteit zijn elimineren. Ten derde, mechanistically, multipliciteit kan voortvloeien uit meerdere synaptic contactpersonen de dezelfde postsynaptisch neuron of multivesicular release (dat wil zeggen meerdere blaasjes vrijgegeven binnen een synaptic éénloket)^17,18. Om te differentiëren tussen de twee soorten multipliciteit, het derde experiment maakt gebruik van een lage affiniteit, snelle distantieert concurrerende antagonist van AMPA receptoren, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 , om te bepalen of grote sEPSC zijn het resultaat van de temporele sommatie van onafhankelijke synapsen of multivesicular release op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren. Als de grote amplitude gebeurtenissen ontstaan uit multivesicular release, zullen γ-DGG minder effectief op remming van de grotere ten opzichte van kleinere sEPSCs, overwegende dat de grote sEPSCs die uit de tijdelijke sommatie van meerdere synaptic contactpersonen voortvloeien op dezelfde manier zal worden beïnvloed door Γ-DGG. In het vierde experiment, wordt een meer fysiologische methode gebruikt ter verbetering van de actiepotentiaal afvuren, namelijk afferent synaptic stimulatie. Uitbarstingen van synaptic activiteit kunnen Transient verhoging/vergemakkelijken de spontane actiepotentiaal afvuren en release kans de afferents gestimuleerd. Deze benadering biedt daarom multipliciteit om in een meer fysiologische manier te manifesteren.

Het volgende protocol beschrijft de methode voor het uitvoeren van deze experimenten in muis hypothalame weefsel. In het bijzonder worden corticotropin releasing hormoon (CRH) neuronen van de kern van de paraventricular van de hypothalamus (PVN) gebruikt. We beschrijven de procedures voor het uitvoeren van geheel-cel patch klem elektrofysiologie en de specifieke experimenten om te testen voor synaptic multipliciteit te verklaren.