طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي
Summary
تم تصميم خط الأنابيب الموصوف لتقسيم مجموعات البيانات المجهرية الكترون أكبر من غيغابايت ، لاستخراج مورفولوجيس الخلية الكاملة. وبمجرد أعاده بناء الخلايا في 3D ، يمكن استخدام البرمجيات المخصصة المصممة حول الاحتياجات الفردية لاجراء تحليل نوعي وكمي مباشره في 3D ، وأيضا باستخدام الواقع الافتراضي للتغلب علي انسداد العرض.
Abstract
التسلسل التسلسلي والتصوير اللاحق عاليه الدقة من الانسجه البيولوجية باستخدام المجهر الكتروني (EM) تسمح للتجزئة وأعاده بناء مكدسات العمر عاليه الدقة للكشف عن الأنماط الهيكلية التي لا يمكن حلها باستخدام 2D الصور. في الواقع ، قد يؤدي هذا الأخير إلى سوء تفسير التحويرات ، كما هو الحال في الميتوكوندريا ؛ استخدام النماذج ثلاثية الابعاد هو ، لذلك ، أكثر وأكثر شيوعا وتطبيقها علي صياغة الفرضيات الوظيفية القائمة علي المورفولوجية. وحتى الآن ، فان استخدام النماذج الثلاثية الابعاد المتولدة من أكوام الصور الضوئية أو الكترونيه يجعل التقييمات النوعية والبصرية ، فضلا عن القياس الكمي ، أكثر ملاءمة لتنفيذها مباشره في الابعاد الثلاثية. وبما ان هذه النماذج غالبا ما تكون معقده للغاية ، فان بيئة الواقع الافتراضي مهمة أيضا لوضعها للتغلب علي الانسداد والاستفادة الكاملة من البنية ثلاثية الابعاد. هنا ، يتم وصف دليل خطوه بخطوه من تجزئه الصورة إلى أعاده البناء والتحليل بالتفصيل.
Introduction
النموذج الأول المقترح لاعداد المجهر الكترون السماح القسم التسلسلي الألى والتصوير يعود إلى 19811; نشر مثل هذه الاجهزه اليه ، وتحسين لصوره عينات كبيره باستخدام EM زادت في السنوات العشر الاخيره2،3، ويعمل عرض الإنشاءات الكثيفة مثيره للإعجاب أو مورفولوجيسكامله فورا يتبع 4 ، 5،6،7،8،9،10.
وجاء إنتاج مجموعات البيانات الكبيرة مع الحاجة إلى خطوط أنابيب محسنه لتجزئه الصور. تم تصميم أدوات البرمجيات للتقسيم اليدوي للأقسام التسلسلية ، مثل أعاده البناء و TrakEM211،12، لنقل المجهر الكتروني (TEM). وبما ان العملية برمتها يمكن ان تستغرق وقتا طويلا للغاية ، فان هذه الاداات ليست مناسبه عند التعامل مع آلاف الرسوم البيانية التسلسلية التي يمكن إنشاؤها تلقائيا باستخدام تقنيات القسم التسلسلي (3DEM) لأحدث التقنيات ، مثل [بلوك-فيس] مسح الكترون مجهر ([سبم])3 أو يركز أيون [شعاع-سكنينغ] الكترون مجهريه ([فل-سم])2. ولهذا السبب ، يبذل العلماء جهودا لتطوير أدوات شبه مؤتمتة ، فضلا عن أدوات مؤتمتة بالبالكامل ، لتحسين كفاءه التجزئة. ويجري تحسين الاداات المؤتمتة بالبالكامل ، استنادا إلى التعلم الألى13 أو الدولة من بين الفن ، خوارزميات تصنيف بكسل غير مدربه14، لاستخدامها من قبل مجتمع أكبر ؛ ومع ذلك ، لا تزال التجزئة بعيده عن ان تكون موثوقه تماما ، والعديد من الاعمال لا تزال قائمه علي العمل اليدوي ، وهو غير فعال من حيث الوقت التجزئة ولكن لا يزال يوفر الموثوقيه الكاملة. وتمثل الاداات شبه المؤتمتة ، مثل ilastik15، حلا توفيقيا أفضل ، لأنها توفر قراءات فورية للتقسيم الذي يمكن تصحيحه إلى حد ما ، علي الرغم من انه لا يوفر اطارا حقيقيا للتصحيح اللغوي ، ويمكن دمجه باستخدام TrakEM2 بالتوازي16.
والتجزئة الواسعة النطاق ، حتى الآن ، تقتصر في معظمها علي الكونيكميات ؛ ولذلك ، فان علماء الكمبيوتر هم الأكثر اهتماما في توفير أطر لمرئيات متكاملة من مجموعات البيانات الكبيرة والمشروحة وتحليل أنماط الاتصال التي يستدل عليها من وجود اتصالات متشابك17،18. ومع ذلك ، يمكن استخدام عمليات أعاده البناء الدقيقة ثلاثية الابعاد للتحليلات الكمية ، بدلا من التقييمات النوعية للهياكل ثلاثية الابعاد. وقد وضعت أدوات مثل نيورومورف19،20 وتحليل الجليكوجين10 لاتخاذ القياسات علي أعاده البناء 3d لأطوال والمناطق السطحية والاحجام ، وعلي توزيع نقاط السحابة ، تماما تجاهل المكدس EM الأصلي8,10. Astrocytes تمثل دراسة حاله مثيره للاهتمام ، لان نقص القرائن البصرية أو الأنماط الهيكلية المتكررة تعطي المحققين تلميحا حول وظيفة الوحدات الهيكلية الفردية وما يترتب علي ذلك من عدم وجود الأخلاقيات الكافية من العمليات استروسيتيك 21، وجعلها صعبه لتصميم الاداات التحليلية. وكانت أحدي المحاولات الاخيره هي المستخرجة22، والتي تسمح بالاستكشاف البصري للعمليات الفلكية والاستدلال علي العلاقات النوعية بين العمليات الفلكية والعصبية.
ومع ذلك ، فان الراحة من الانسجه التصويرية تحت EM ياتي من حقيقة ان كميه المعلومات المخباه في عينات الدماغ سليمه هائله وتفسير الصور قسم واحد يمكن التغلب علي هذه المسالة. كثافة الهياكل في الدماغ عاليه جدا ان أعاده البناء 3D حتى من الكائنات القليلة مرئية في وقت واحد من شانه ان يجعل من المستحيل تمييزها بصريا. لهذا السبب ، اقترحنا مؤخرا استخدام الواقع الافتراضي (VR) كطريقه محسنه لمراقبه الهياكل المعقدة. ونحن نركز علي استروسيتيس23 للتغلب علي انسداد (وهو حجب رؤية كائن من الفائدة مع الثانية ، في الفضاء 3d) وسهوله التقييمات النوعية لأعاده البناء ، بما في ذلك التدقيق اللغوي ، وكذلك كميات من الميزات باستخدام عدد النقاط في الفضاء. جمعنا مؤخرا الاستكشاف البصري VR مع استخدام جلام (الجليكوجين المستمدة من اللاكتات امتصاص نموذج) ، وهي تقنيه لتصور خريطة لاحتمال مكوك اللاكتات من العصب ، من خلال النظر في حبيبات الجليكوجين والهيئات التي ينبعث منها الضوء23؛ علي وجه الخصوص ، استخدمنا VR لقياس القمم الضوئية التي تنتجها جلام.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المعروضة هنا هي دليل خطوه بخطوه مفيده لتقسيم وأعاده بناء 3D من مجموعه البيانات EM متعددة المقاييس ، سواء كانت تاتي من تقنيات التصوير عاليه الدقة ، مثل التقنية المؤسسية-SEM ، أو غيرها من العمليات المتسلسلة الألى والتصوير تقنيات. الاكذوبه-SEM لديه ميزه الوصول المحتملة الكمال في حجم فوكسل بقطع مقاطع رقيقه مثل 5 نانومتر باستخدام شعاع أيون مركزه ، فوف قد تكون محدوده ل 15-20 μm بسبب التحف الجانبية ، والتي ربما بسبب ترسب الانسجه قطع إذا كان FO V يتجاوز هذه القيمة. ويمكن تجنب مثل هذه القطع الاثريه باستخدام تقنيات أخرى ، مثل SBEM ، الذي يستخدم سكين الماس لقطع المقاطع التسلسلية داخل غرفه المجهر. في هذه الحالة الاخيره ، يمكن ان يكون القرار z حول 20 نانومتر في أحسن الأحوال (عاده ، 50 نانومتر) ، ولكن فوف قد يكون أكبر ، علي الرغم من ان القرار بكسل يجب ان يكون عرضه للخطر لمنطقه شاسعه من الاهتمام. حل واحد للتغلب علي هذه القيود (التكبير مقابل فوف) هو تقسيم المنطقة من الاهتمام في البلاط والحصول علي كل واحد منهم في قرار اعلي. لقد أظهرنا هنا النتائج من كل من المكدس SBEM-مجموعه البيانات (ط) في النتائج التمثيلية-والاكذوبه-SEM كومه-البيانات (2) في النتائج التمثيلية.
ومع تزايد شيوع توليد مجموعات البيانات الأكبر حجما والأكبر حجما ، تتزايد الجهود المبذولة لإيجاد أدوات لتصنيف البيكسل والتجزئة المؤتمتة للصور. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم يثبت اي برنامج موثوقيه مماثله لتلك التي من التدقيق اللغوي البشري ، ولذلك لا يزال من الضروري ، بغض النظر عن مدي مضيعه للوقت. وبشكل عام ، يمكن أعاده تشكيل مجموعات البيانات الصغيرة التي يمكن اختزالها ، كما في حاله مجموعه البيانات ‘ 2 ‘ ، بشكل كثيف من قبل مستخدم واحد خبير في الأسبوع ، بما في ذلك وقت التدقيق اللغوي.
البروتوكول المعروض هنا ينطوي علي استخدام ثلاثه برامج البرمجيات علي وجه الخصوص: فيجي (الإصدار 2.0.0/1.65 b) ، ilastik (الإصدار 1-3-2 rc2) ، وخلاط (2.79) ، والتي هي جميع البرامج مفتوحة المصدر ومتعددة منصة وتحميلها مجانا. فيجي هو الإفراج عن ImageJ ، مدعوم من الإضافات لتحليل الصور البيولوجية. لديها بنيه البرمجيات قويه ويقترح كما هو منصة مشتركه للعلماء الحياة ويشمل TrakEM2 ، واحده من الإضافات الاولي والأكثر استخداما علي نطاق واسع لتقسيم الصورة. مشكله واحده من قبل العديد من المستخدمين في الاونه الاولي هو الانتقال من جافا 6 إلى Java 8 ، الذي يقوم بإنشاء مشاكل التوافق. لذلك ، نقترح الامتناع عن التحديث إلى Java 8 ، ان أمكن ، للسماح لفيجي بالعمل بشكل صحيح. ilastik هو برنامج قوي يوفر عددا من الأطر لتصنيف بكسل ، كل واحد موثق وشرح علي موقعه علي الإنترنت. وحده نحت المستخدمة لتقسيم شبه الألى من مكدسات EM مريحه لأنه يوفر الكثير من الوقت ، مما يسمح للعلماء للحد من الوقت المستغرق في العمل اليدوي من أشهر إلى أيام لمستخدم من ذوي الخبرة ، كما هو الأمر مع بنقره واحده يمكن ان يكون العصب بأكمله مجزاه في ثوان. خطوه المعالجة المسبقة مكثفه جدا من وجهه نظر الاجهزه ، ومجموعات البيانات الكبيرة جدا ، مثل كومه SBEM قدمت هنا ، والتي كانت 26 غيغابايت ، تتطلب استراتيجيات غريبه لتناسب الذاكرة ، معتبرا ان واحدا من شانه ان يكتسب مجموعه بيانات كبيره لأنه لا يمكن تسويه مجال الرؤية والحل. ولذلك ، قد لا يكون الاختزال حلا مناسبا في هذه الحالة. أحدث إصدار من البرنامج يمكن ان تفعل المعالجة المسبقة في بضع ساعات مع محطه عمل لينكس قويه ، ولكن تقسيم سيستغرق دقائق ، والتمرير من خلال المكدس سيكون لا يزال بطيئا نسبيا. لا نزال نستخدم هذه الطريقة لأول ، والتجزئة الخام ، وتدقيقها باستخدام TrakEM2. وأخيرا ، خلاط هو برنامج 3D النمذجة ، مع محرك العرض 3D قويه ، والتي يمكن تخصيصها مع البرامج النصية بيثون التي يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا في واجهه المستخدم الرسوميه الرئيسية كوظائف اضافيه ، مثل نيورومورف وتحليل الجليكوجين. مرونة هذا البرنامج ياتي مع العيب الذي ، علي النقيض من فيجي ، علي سبيل المثال ، لم يتم تصميمه لتصور علي الإنترنت من مجموعات البيانات الكبيرة ؛ لذلك ، قد يكون التصور والتنقل من خلال شبكات كبيره (تتجاوز 1 غيغابايت) بطيئه وغير فعاله. وبسبب هذا ، فانه من المستحسن دائما لاختيار التقنيات التي تقلل من تعقيد شبكه ولكن حريصون علي عدم تعطيل المورفولوجية الأصلي للهيكل الفائدة. وتاتي وظيفة رمش في متناول اليدين وهي ميزه مضمنه في أداه استيراد نيورومورف الدفعي. مشكله مع هذه الدالة هو انه ، اعتمادا علي عدد القمم من الشبكة الاصليه ، يجب تعديل قيمه عمق octree ، والتي ترتبط بالدقة النهائية ، وفقا لذلك. يمكن أعاده الكائنات الصغيرة مع عمق ثماني شجره صغيره (علي سبيل المثال 4) ، ولكن نفس القيمة قد يعطل تشكل الأجسام الكبيرة ، والتي تحتاج إلى قيم أكبر (6 في أحسن الحال ، إلى 8 أو حتى 9 لشبكه كبيره جدا ، مثل خليه كامله). فانه من المستحسن لجعل هذه العملية تكراريه واختبار أعماق octree مختلفه إذا كان حجم الكائن غير واضح.
وكما ذكر سابقا ، فان أحد الجوانب التي ينبغي مراعاتها هو القدرة الحسابية التي ستكرس لأعاده البناء والتحليل ، المتصلة بالبرمجيات المستخدمة. تم الحصول علي جميع العمليات المبينة في النتائج التمثيلية لهذه المخطوطة باستخدام MacPro ، مجهزه ببطاقة جرافيكس AMD FirePro كاميرا d500 ، 64 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي ، ووحده المعالجة المركزية Intel Xeon E5 مع 8 النوى. فيجي لديها بنيه برمجيات جيده للتعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة; ولذلك ، فمن المستحسن استخدام جهاز كمبيوتر محمول مع أداء الاجهزه جيده ، مثل ماك بوك برو مع 2.5 غيغاهرتز انتل i7 وحده المعالجة المركزية و 16 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي. ilastik البرمجيات هو أكثر تطلبا من حيث الموارد الاجهزه ، ولا سيما اثناء مرحله ما قبل المعالجة. علي الرغم من ان اختزال الصورة المكدس هو خدعه جيده للحد من طلبات الاجهزه من البرنامج ويسمح للمستخدم لمعالجه كومه مع جهاز كمبيوتر محمول (عاده إذا كان اقل من 500 بكسل في x,y,z), نقترح استخدام الراقية كمبيوتر لتشغيل هذا البرنامج بسلاسة. نحن نستخدم محطه عمل مجهزه انتل زيون الذهب 6150 وحده المعالجة المركزية مع 16 النوى و 500 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي.
عندما تقدم مع أعاده الاعمار 3D دقيقه ، يمكن للعلماء تجاهل الرسوم البيانية الاصليه والعمل مباشره علي نماذج 3D لاستخراج البيانات المفيدة مورفمتري لمقارنه الخلايا من نفس النوع ، فضلا عن أنواع مختلفه من الخلايا ، والاستفادة من الواقع الافتراضي التقييمات النوعية والكمية للموولوجيات. وعلي وجه الخصوص ، اثبت استخدام هذه الاخيره فائدته في حاله تحليلات التحويرات الكثيفة أو المعقدة التي تمثل انسدادا بصريا (اي عرقله الرؤية لموضوع الفائدة في الحيز الثلاثي الابعاد بواسطة ثانيه واحده توضع بين المراقب والغير الكائن الواحد) ، مما يجعل من الصعب تمثيلها وتحليلها في 3D. في المثال المقدم ، استغرق المستخدم المتمرس حوالي 4 ساعات غير متتابعة لمراقبه مجموعات البيانات وحساب الكائنات. قد يختلف الوقت المستغرق في تحليل الواقع الافتراضي لان جوانب مثل مرض الواقع الافتراضي (والتي يمكن ، إلى حد ما ، ان تكون ذات صله بمرض السيارة) يمكن ان يكون لها تاثير سلبي علي تجربه المستخدم. في هذه الحالة ، قد يفضل المستخدم أدوات التحليل الأخرى ويحد من وقته المخصص للواقع الافتراضي.
وأخيرا ، يمكن تطبيق كل هذه الخطوات علي المجهرية الأخرى والتقنيات غير EM التي تولد مكدسات الصور. EM يولد الصور التي هي ، بشكل عام ، تحديا للتعامل مع والقطاع ، مقارنه مع ، علي سبيل المثال ، المجهر الفلوري ، حيث شيء مماثل لقناع ثنائي (اشاره مقابل خلفيه سوداء) ، والتي يمكن في المبدا يمكن تقديمها بسهوله في 3D مزيد من المعالجة ، وغالبا ما يحتاج إلى التعامل معها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل جامعه الملك عبد الله للعلوم والتكنولوجيا (KAUST) منح البحوث التنافسية (CRG) منحه “تحالف KAUST-BBP لنمذجة تكامليه لاستقلاب طاقة الدماغ” إلى P.J.M.
Materials
| Fiji | Open Source | 2.0.0-rc-65/1.65b | Open Source image processing editor www.fiji.sc |
| iLastik | Open Source | 1.3.2 rc2 | Image Segmentation tool www.ilastik.org |
| Blender | Blender Foundation | 2.79 | Open Source 3D Modeling software www.blender.org |
| HTC Vive Headset | HTC | Vive / Vive Pro | Virtual Reality (VR) Head monted headset www.vive.com |
| Neuromorph | Open Source | — | Collection of Blender Addons for 3D Analysis neuromorph.epfl.ch |
| Glycogen Analysis | Open Source | — | Blender addon for analysis of Glycogen https://github.com/daniJb/glyco-analysis |
| GLAM | Open Source | — | C++ Code For generating GLAM Maps https://github.com/magus74/GLAM |
References
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28, 2959-2964 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2, e329 (2004).
- Coggan, J. S., et al. A Process for Digitizing and Simulating Biologically Realistic Oligocellular Networks Demonstrated for the Neuro-Glio-Vascular Ensemble. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct Profiles of Myelin Distribution Along Single Axons of Pyramidal Neurons in the Neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19, 816-825 (2016).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
- Calì, C., et al. The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex—A 3D electron microscopy analysis of layer 1. PLOS ONE. 13, e0198131 (2018).
- Calì, C., Agus, M., Gagnon, N., Hadwiger, M., Magistretti, P. J. Visual Analysis of Glycogen Derived Lactate Absorption in Dense and Sparse Surface Reconstructions of Rodent Brain Structures. , (2017).
- Calì, C., et al. Three-dimensional immersive virtual reality for studying cellular compartments in 3D models from EM preparations of neural tissues. Journal of Comparative Neurology. 524, 23-38 (2016).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7, e38011 (2012).
- Januszewski, M., et al. High-precision automated reconstruction of neurons with flood-filling networks. Nature Methods. 1, (2018).
- Shahbazi, A., et al. Flexible Learning-Free Segmentation and Reconstruction of Neural Volumes. Scientific Reports. 8, 14247 (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. , (2011).
- Holst, G., Berg, S., Kare, K., Magistretti, P., Calì, C. Adding large EM stack support. , (2016).
- Beyer, J., et al. ConnectomeExplorer: query-guided visual analysis of large volumetric neuroscience data. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 19, 2868-2877 (2013).
- Beyer, J., et al. Culling for Extreme-Scale Segmentation Volumes: A Hybrid Deterministic and Probabilistic Approach. IEEE Transactions on Visualization and Computer. , (2018).
- Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13, 83-92 (2015).
- Jorstad, A., Blanc, J., Knott, G. NeuroMorph: A Software Toolset for 3D Analysis of Neurite Morphology and Connectivity. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 59 (2018).
- Calì, C. Astroglial anatomy in the times of connectomics. Journal of Translational Neuroscience. 2, 31-40 (2017).
- Mohammed, H., et al. Abstractocyte: A Visual Tool for Exploring Nanoscale Astroglial Cells. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. , (2017).
- Agus, M., et al. GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments. Computers & Graphics. 74, 85-98 (2018).
- École Polytechnique Fédérale de Lausanne. . NeuroMorph Analysis and Visualization Toolset. , (2018).
- . GitHub – daniJb/glycol-analysis: Glycogen_analysis.py is a python-blender API based script that performs analysis on a reconstructed module of glycogen data Available from: https://github.com/daniJb/glyco-analysis (2018)
- . GitHub – magus74/GLAM: Glycogen Lactate Absorption Model Available from: https://github.com/magus74/GLAM (2019)
- Agus, M., et al. GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments. Dryad Digital Repository. , (2018).
- Calì, C., et al. Data from: The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex—A 3D electron microscopy analysis of layer 1. Dryad Digital Repository. , (2018).
