Sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna del Oligonucleotide
Summary
Dimostriamo la sintesi di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna effettiva del oligonucleotide in vitro e in vivo. Silicio poroso nanoparticelle vengono caricate con siRNA per formare il nucleo, che è rivestito dai lipidi fusogena attraverso estrusione per formare il guscio. I servizi e le dotazioni comprendono targeting frazione funzionalizzazione e caratterizzazione delle particelle.
Abstract
Con l’avvento della terapia genica, lo sviluppo di un sistema di consegna efficaci in vivo del nucleotide-payload è diventata di importazione parallela. Fusogena silicio poroso nanoparticelle (F-pSiNPs) hanno recentemente dimostrato alto genico in vivo di efficacia a causa sua oligonucleotide ad alto capacità di carico e via di assorbimento cellulare unico che evita endocitosi. La sintesi di F-pSiNPs è un processo a più fasi che include: (1) di carico e la sigillatura di payload del oligonucleotide nei pori di silicio; (2) rivestimento simultanea e dimensionamento dei lipidi fusogena intorno i nuclei di silicio poroso; e (3) coniugazione di peptidi di targeting e lavaggio per rimuovere l’eccesso del oligonucleotide, detriti di silicio e il peptide. Uniformità di dimensione della particella è caratterizzata da diffusione dinamica della luce, e la sua struttura core-shell può essere verificata da microscopia elettronica di trasmissione. L’assorbimento di fusogena viene convalidato caricando un lipofilico tingere, 1, 1′-Diottadecilbis-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), in bilayer del lipido fusogena e trattandolo alle cellule in vitro per osservare per membrana plasmatica colorazione contro localizzazioni endocitosi. I efficacies di silenziamento gene targeting e in vivo in precedenza sono stati quantificati in un modello murino di polmonite Staphylococcus aureus , in cui è previsto il peptide targeting per aiutare il F-pSiNPs a casa per il sito di infezione. Oltre la sua applicazione nell’infezione di S. aureus , il sistema di F-pSiNP può essere usato per fornire qualsiasi oligonucleotide per la terapia genica di una vasta gamma di malattie, compreso le infezioni virali, cancro e malattie autoimmuni.
Introduction
Terapia genica modula l’espressione genica specifici per ottenere un risultato terapeutico. Numerosi strumenti per la modulazione del gene sono stati scoperti e studiati, compreso acido ribonucleico interferenza (RNAi) utilizzando oligonucleotidi (ad es., breve interfering RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmidi5,6, nucleasi (ad es., dito di zinco, TALENS)7,8e CRISPR/Cas9 sistemi9,10. Mentre il meccanismo di ciascuno strumento di azione è diverso, tutti gli strumenti deve raggiungere il citoplasma della cellula o il nucleo è attivo. Come tale, mentre questi strumenti hanno dimostrato di indurre un effetto significativo nella modulazione della espressione genica in vitro, in vivo l’efficacia soffre da ostacoli extracellulari ed intracellulari. Dovuto al fatto che gli strumenti sono di origine biologica, molti enzimi e sistemi di sdoganamento esistano nel nostro corpo che hanno la capacità di degradare o rimuovere le molecole estranee11. Anche nel caso che gli strumenti di raggiungano la cella obiettivo, essi soffrono di endocitosi; una modalità di assorbimento cellulare che incapsula e intrappola gli strumenti in acido dello stomaco-come vescicole che degradano o espellere gli strumenti fuori dalla cella. Infatti, studi hanno dimostrato che nanoparticelle lipidiche sono stimolazione tramite Macropinocitosi, da cui circa il 70% dei siRNA sono exocytosed dalle cellule all’interno di 24h di assorbimento12,13. La maggior parte del siRNA rimanente vengono degradata attraverso il pathway lisosomiale, e in definitiva soltanto 1-2% di siRNA che inizialmente entra nella cellula con le nanoparticelle ottenere fuga endosomal potenzialmente subire RNAi13,14 .
Recentemente abbiamo sviluppato le nanoparticelle di silicio poroso fusogena (F-pSiNPs) che hanno un nucleo caricato siRNA composto di silicio poroso nanoparticelle e un fusogena lipidica shell15. F-pSiNPs presentano tre vantaggi principali rispetto ad altri sistemi di consegna del oligonucleotide convenzionale: (1) un lipide fusogena rivestimento che permette alle particelle di bypassare endocitosi e consegnare l’intero payload direttamente nel citoplasma delle cellule (contro l’1-2% raggiunto da stimolazione particelle13,14) (Figura 1); (2) carico di massa elevata di siRNA nella pSiNPs (> 20% in peso rispetto al 1-15 wt % dai sistemi convenzionali)15, che degradano rapidamente nel citoplasma (una volta che le particelle del nucleo capannone il rivestimento lipidico tramite l’assorbimento fusogena) per rilasciare il siRNA; e (3) targeting coniugazione del peptide per homing selettiva al desiderato tipi di cellule in vivo.
Il sistema F-pSiNP ha dimostrato notevole efficacia il silenziamento genico (> 95% in vitro; > 80% in vivo) e conseguente effetto terapeutico in un modello murino mortale di polmonite Staphylococcus aureus ; i risultati di cui sono stati pubblicati in precedenza15. Tuttavia, la complessa struttura del sistema F-pSiNP richiede manipolazioni delicate e ottimizzazione fine-tuned per generare nanoparticelle uniforme e stabile. Così, lo scopo di questo lavoro è di presentare un protocollo approfondito, nonché strategie di ottimizzazione per la sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di F-pSiNPs per essere utilizzato in somministrazione mirata di siRNA per effetto di silenziamento del gene potente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sintesi di nanoparticelle di silicio poroso sono illustrato nella Figura 5. Il passaggio fondamentale nella sintesi di fusogena pSiNPs è in fase di caricamento (passaggio 3). Se le nanoparticelle fusogena aggregano post-sintesi (Figura 3), il motivo potrebbe essere a causa di quanto segue: (1) stock di cloruro di calcio non era preparato omogeneamente, così passo 3.1.2 dovrà essere attentamente seguito o raffinato; o (2) il rapporto di pSiNP: siRNA: CaCl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health attraverso contratto n # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
