סינתזה Functionalization, איפיון חלקיקים הסיליקון הנקבובי Fusogenic למסירה Oligonucleotide
Summary
נדגים את הסינתזה של חלקיקים fusogenic הסיליקון הנקבובי למסירה oligonucleotide במבחנה, ויוו יעיל. הסיליקון הנקבובי חלקיקים נטענים עם siRNA ליצירת הליבה, שהטיחה מאת fusogenic שומנים דרך ההבלטה כדי ליצור את הקליפה. Functionalization moiety מיקוד איפיון חלקיקים הינם כלולים.
Abstract
עם כניסתו של טיפול גנטי, הפך התפתחות מערכת משלוחים יעיל ויוו נוקלאוטיד-המטען של ייבוא מקביל. Fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) הראו לאחרונה גבוהה ג’ין ויוו להשתיק היעילות עקב שלה oligonucleotide גבוהה טעינה קיבולת ועל מסלול ייחודי ספיגת הסלולר זה מונע אנדוציטוזה. הסינתזה של F-pSiNPs הוא תהליך רב שלבי הכולל: טעינת ואיטום (1) oligonucleotide דים על נקבוביות הסיליקון; (2) ציפוי סימולטני ושינוי של fusogenic שומנים סביב הליבות הסיליקון הנקבובי; (3) ההטיה של פילוח פפטידים ושטיפת להסיר את עודף oligonucleotide, סיליקון פסולת ופפטיד. האחידות בגודל של החלקיק מאופיין על ידי פיזור אור דינאמי, מבנהו ליבה-קליפה ניתן לבירור על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תפיסה fusogenic מאומתת על-ידי טעינת lipophilic לצבוע, 1, 1′-dioctadecyl-3,3, 3′, פרכלורט 3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI), לתוך fusogenic שכבה ליפידית וטיפול זה לתאים במבחנה להתבונן על קרום פלזמה מכתים לעומת endocytic localizations. המטרה ואת ויוו ג’ין שתיקה efficacies היו בעבר לכמת במודל של עכברים של דלקת ריאות Staphylococcus aureus , שבו פפטיד מיקוד צפוי לעזור F-pSiNPs לבית לאתר של זיהום. מעבר היישום שלה ב- S. aureus זיהום, מערכת F-pSiNP עשוי לשמש כדי לספק כל oligonucleotide עבור ריפוי גנטי של מגוון רחב של מחלות, כולל זיהומים נגיפיים, סרטן ומחלות אוטואימוניות.
Introduction
ריפוי גנטי ממיקרו ביטוי גנים ספציפיים כדי לקבל תוצאה טיפולית. כלים רבים עבור ג’ין אפנון יש כבר גילה ולמד, כולל הפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi) באמצעות oligonucleotides (למשל, קצר מפריעות RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ה-DNA פלסמידים5,6, nucleases (למשל, אצבע אבץ, TALENS)7,8, ו CRISPR/Cas9 מערכות9,10. בזמן של הכלי כל מנגנון פעולה שונה, כל הכלים צריך להגיע הציטופלסמה של התא או את הגרעין להיות פעילים. ככזה, בעוד כלים אלה הוכיחו לזירוז השפעה משמעותית של הכוח ויסות גנים במבחנה, היעילות ויוו סובל מכשולים חוץ-תאית, תאיים. בשל העובדה כי הכלים הם ממקור ביולוגי, אנזימים רבים, מערכות סליקה קיים בגוף שלנו יש את היכולת להשפיל או להסיר את מולקולות זרות11. אפילו במקרה כי הכלים להגיע לתא המטרה, הם סובלים אנדוציטוזה; מצב של ספיגת הסלולר מבצע אנקפסולציה, מלכודות הכלים בשלפוחית כמו קיבה חומצי לבזות או לגרש את הכלים מחוץ לתאים. למעשה, מחקרים הראו כי השומנים חלקיקים הם endocytosed ויה macropinocytosis, שממנו הם כ- 70% siRNA exocytosed את התאים בתוך 24 שעות של ספיגת12,13. רוב siRNA הנותרים הם השפיל דרך השביל lysosomal, ולהשיג בסופו של דבר רק 1-2% של siRNA המוסיפה בתחילה את התא עם חלקיקים endosomal לברוח העלול לעבור RNAi13,14 .
לאחרונה פיתחנו fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) בעלות של הליבה siRNA טעון מורכב הסיליקון הנקבובי חלקיקים, ו fusogenic השומנים מעטפת15. F-pSiNPs מציגים שלושה יתרונות עיקריים על פני מערכות אחרות oligonucleotide המקובלת: (1) ליפופרוטאין fusogenic ציפוי המאפשר את החלקיקים לעקוף אנדוציטוזה ולספק את כל המטען ישירות בציטופלסמה תא (לעומת % 1-2 מושגת על-ידי endocytosed חלקיקים13,14) (איור 1); (2) הטעינה מסה גבוהה של siRNA ב pSiNPs (> 20% wt לעומת wt 1-15% על ידי מערכות קונבנציונלי)15, אשר במהירות לבזות בציטופלסמה (פעם החלקיקים הליבה לשפוך את ציפוי השומנים דרך ספיגת fusogenic) כדי לשחרר את siRNA; (3) מיקוד פפטיד ההטיה של יונת סלקטיבית כדי הרצוי סוגי תאים ויוו.
מערכת F-pSiNP הוכיחה משמעותית ג’ין להשתיק יעילות (> גופית; 95% > 80% ויוו) ואת האפקט הטיפולי עוקבות במודל של עכברים קטלנית של S. aureus דלקת ריאות; התוצאות אשר פורסמו בעבר15. עם זאת, המבנה המורכב של מערכת F-pSiNP דורש התייחסות רגישה ואופטימיזציה מכויל כדי ליצור חלקיקים אחיד ויציב. לפיכך, מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול יסודי, וכן אסטרטגיות אופטימיזציה עבור סינתזה, functionalization, אפיון של F-pSiNPs כדי לשמש יישוב מסירת siRNAs לאפקט שתיקה ג’ין חזק.
Protocol
Representative Results
Discussion
סינתזה של חלקיקים הסיליקון הנקבובי מוצג באיור5. השלב הקריטי בסינתזה של fusogenic pSiNPs הוא שלב ההעמסה (שלב 3). אם הנך מסכם חלקיקים fusogenic שלאחר סינתזה (איור 3), הסיבה לכך יכול להיות בגלל הבאות: (1) סידן כלורי המניה לא הוכן למשל, ולכן שלב 3.1.2 יש בקפידה עקב או מעודן; או (2) היח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מכוני הבריאות הלאומיים דרך חוזה # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
