Synthese, Functionalization en karakterisatie van Fusogenic poreuze Silicon nanodeeltjes voor Oligonucleotide levering
Summary
We laten zien dat de synthese van fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes voor effectieve in vitro en in vivo oligonucleotide levering. Poreuze silicon nanodeeltjes worden geladen met siRNA vormen de kern, die is bedekt door fusogenic lipiden door middel van extrusie te vormen van de shell. Targeting deel functionalization en karakterisering van het deeltje worden opgenomen.
Abstract
Met de komst van gentherapie, de ontwikkeling van een effectief in vivo nucleotide-nettolading uitvoeringssysteem geworden van parallelle invoer. Fusogenic poreuze silicon nanodeeltjes (F-pSiNPs) hebben onlangs aangetoond dat hoge in vivo gene werkzaamheid te wijten aan de hoge oligonucleotide laden capaciteit en unieke cellulaire opname traject dat endocytose vermijdt zwijgen. De synthese van F-pSiNPs is een multi-stap proces dat omvat: (1) laden en afdichten van oligonucleotide payloads in het silicium poriën; (2) gelijktijdige coating en dimensionering van fusogenic lipiden rond de poreuze silicon kernen; en (3) vervoeging van targeting peptiden en wassen als u wilt verwijderen van de overtollige oligonucleotide, silicium puin en peptide. Van het deeltje grootte uniformiteit wordt gekenmerkt door Dynamische lichtverstrooiing en de structuur van de kern-shell kan worden gecontroleerd door transmissie-elektronenmicroscopie. De opname van de fusogenic is gevalideerd door het laden van een lipofiele kleurstof, 1, 1′-dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI), in de fusogenic lipide dubbelgelaagde en behandelen naar cellen in vitro te observeren voor plasmamembraan kleuring endocytotische lokalisaties. De doelgerichtheid en in vivo gene silencing efficacies waren eerder gekwantificeerd in een muismodel van Staphylococcus aureus -pneumonie, waarin de targeting peptide wordt verwacht om te helpen de F-pSiNPs naar huis naar de plaats van de infectie. Buiten de toepassing ervan in S. aureus -infectie, kan de F-pSiNP-systeem worden gebruikt voor elke oligonucleotide voor gentherapie van een breed scala van ziekten, met inbegrip van virale infecties, kanker en auto-immune ziekten.
Introduction
Gentherapie moduleert specifieke genexpressie om te verkrijgen van een therapeutische resultaat. Tal van hulpmiddelen voor gene modulatie hebben ontdekt en bestudeerd, met inbegrip van RNA zuur interferentie (RNAi) met behulp van oligonucleotides (bijvoorbeeld korte Mengend RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmiden5,6, nucleasen (bijvoorbeeld zink vinger, TALENS)7,8, en9,10van de systemen van de CRISPR/Cas9. Terwijl van elk hulpprogramma werkingsmechanisme verschilt, moet alle hulpmiddelen van de cel cytoplasma of de celkern actief bereiken. Als zodanig, terwijl deze tools hebben bewezen voor het opwekken van aanzienlijke invloed bij het moduleren van genexpressie in vitro, lijdt in vivo werkzaamheid extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Wijten aan het feit dat de instrumenten van biologische oorsprong zijn, bestaan vele enzymen en goedkeuring systemen in ons lichaam die hebben de mogelijkheid om te degraderen of te verwijderen van de vreemde moleculen11. Zelfs in het geval lijden dat de extra de doelcel bereiken, zij aan endocytose; een modus van cellulaire opname die kapselt en de hulpprogramma’s in de zure maag-achtige blaasjes die degraderen of royement van de hulpprogramma’s uit de cel overlapt. In feite, hebben studies aangetoond dat lipide nanodeeltjes endocytosed via macropinocytosis worden, waaruit zijn ongeveer 70% van de siRNA exocytosed uit de cellen binnen de 24 uur van opname12,13. De meerderheid van de resterende siRNA zijn gedegradeerd door de lysosomale traject, en uiteindelijk slechts 1-2% van de siRNA die aanvankelijk de cel met de nanodeeltjes invoert bereiken endosomal ontsnappen naar potentieel ondergaan RNAi13,14 .
Onlangs hebben we de fusogenic poreus silicon nanodeeltjes (F-pSiNPs) die een siRNA-geladen kern bestaat uit poreus silicon nanodeeltjes en een fusogenic lipide shell15hebben ontwikkeld. De F-pSiNPs presenteren drie grote voordelen ten opzichte van andere conventionele oligonucleotide levering systemen: (1) een fusogenic lipide coating waardoor de deeltjes te omzeilen endocytose en de hele lading leveren rechtstreeks in het cytoplasma van de cel (tegenover de 1-2% bereikt door endocytosed deeltjes13,14) (Figuur 1); (2) hoge massa laden van siRNA in de pSiNPs (> 20 wt % vergeleken met 1-15 wt % door conventionele systemen)15, die snel degraderen in het cytoplasma (zodra de kern deeltjes werpen de lipide coating via fusogenic opname) tot het vrijgeven van siRNA; en (3) peptide vervoeging voor selectieve homing te richten gewenst celtypes in vivo.
De F-pSiNP systeem gebleken belangrijke gene werkzaamheid zwijgen (> 95% in vitro; > 80% in vivo) en latere therapeutisch effect in een fatale muismodel van S. aureus -pneumonie; de resultaten van die werden gepubliceerd eerder15. De complexe structuur van de F-pSiNP-systeem vereist echter delicate behandeling en verfijnd optimalisatie voor het genereren van homogeen en bestendig nanodeeltjes. Dus, is het doel van dit werk te presenteren een grondige protocol, evenals optimalisatie strategieën voor de synthese, functionalization en karakterisatie van F-pSiNPs moet worden gebruikt bij gerichte levering van siRNAs voor krachtige gene silencing effect.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synthese van poreuze silicon nanodeeltjes is afgebeeld in Figuur 5. De kritische stap in de synthese van fusogenic pSiNPs is in de laden stap (stap 3). Als de fusogenic-nanodeeltjes zijn aggregeren na synthese (Figuur 3), de reden kan worden veroorzaakt door het volgende: (1) calciumchloride voorraad homogeen niet bereid was, dus stap 3.1.2 moet zorgvuldig gevolgd of geraffineerd; of (2) de verhouding tussen pSiNP: siRNA: CaCl2 of de concentratie van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health door contract # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
