توليف، الروغان، وتوصيف جسيمات نانوية مسامية السليكون فوسوجينيك لإيصال اليغنوكليوتيد
Summary
علينا أن نظهر توليف فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية لتسليم اليغنوكليوتيد في المختبر والمجراه في فعالية. جسيمات نانوية مسامية السليكون هي محملة siRNA النموذج الأساسية، التي هي مغلفة بالدهون فوسوجينيك عن طريق البثق لتشكيل shell. يتم تضمين استهداف مجموعة الروغان وتوصيف الجسيمات.
Abstract
ومع ظهور العلاج الجيني، أصبح تطوير نظام التسليم الفعال المجراة في النوكليوتيدات-حمولة الاستيراد الموازي. مؤخرا أظهرت فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) عالية الجيني المجراة في إسكات فعاليتها بسبب ما اليغنوكليوتيد عالية تحميل القدرات ومسار امتصاص الخلوية الفريدة التي تتجنب الالتقام. توليف بسينبس و هو عملية متعددة الخطوات تتضمن: (1) تحميل وختم حمولات اليغنوكليوتيد في المسام السليكون؛ (2) المتزامنة طلاء والتحجيم من الدهون فوسوجينيك حول النوى سليكون المليئة بالثغرات؛ والتصريف (3) استهداف الببتيدات والغسيل لإزالة اليغنوكليوتيد الزائدة والحطام السليكون الببتيد. التوحيد حجم الجسيمات تتسم بالديناميكية ونثر الضوء، ومن الممكن التحقق من بنيتها الأساسية-شل مجهر إلكتروني. يتم التحقق من امتصاص فوسوجينيك بتحميل محبتين صبغ، 1, 1 ‘-ديوكتاديسيل-3,3، 3’, بيركلورات 3 ‘–تيتراميثيليندوكاربوسيانيني (دي)، إلى بلير دهن فوسوجينيك وعلاجها بالخلايا في المختبر لمراقبة لغشاء البلازما تلطيخ مقابل تعريب اندوسيتيك. تم قياس كمية بلغت إسكات الجينات الاستهداف والمجراه في سابقا في نموذج ماوس للالتهاب الرئوي من المكوّرات العنقودية الذهبية ، التي يتوقع الببتيد الاستهداف للمساعدة وبسينبس للصفحة الرئيسية لموقع الإصابة. بعد تطبيقه في المذهبة س. العدوى، يمكن استخدام النظام و بسينب لتسليم أي اليغنوكليوتيد للعلاج الجيني لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية.
Introduction
العلاج الجيني ينظم التعبير الجيني محددة الحصول على نتيجة العلاج. تم اكتشاف العديد من أدوات للتحوير الجيني ودراستها، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) باستخدام النوكليوتيد (مثلاً، قصيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)1،2، ميكرورنا (ميرنا)3،4 )، الحمض النووي والبلازميدات5،6، نوكليسيس (مثلاً، إصبع الزنك، تالينس)7،8، ونظم كريسبر/Cas99،10. بينما يختلف إليه كل أداة عمل، جميع الأدوات يجب أن تصل إلى السيتوبلازم للخلية أو النواة تكون نشطة. على هذا النحو، بينما أثبتت هذه الأدوات للحث على تأثير كبير على تحوير الجينات في المختبر، ونجاعة المجراة في تعاني من عقبات خارج الخلية وداخل الخلية. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الأدوات التي من أصل بيولوجي، العديد من الإنزيمات ونظم إزالة الألغام موجودة في الجسم التي لها القدرة على تخفيض أو إزالة الجزيئات الأجنبية11. حتى في الحالة أن الأدوات التي تصل إلى الخلية المستهدفة، وأنهم يعانون من الالتقام؛ طريقة لامتصاص الخلوية التي تقوم بتغليف والفخاخ الأدوات الموجودة في حويصلات تشبه المعدة الحمضية التي تتحلل أو طرد أدوات الخروج من الزنزانة. في الواقع، لقد أظهرت الدراسات أن الدهون جسيمات نانوية المبتلعة عن طريق ماكروبينوسيتوسيس، التي هي اكسوسيتوسيد حوالي 70% من siRNA من الخلايا ضمن ح 24 لاستيعاب12،13. غالبية siRNA المتبقية هي المتدهورة من خلال المسار الليزوزومية، وفي نهاية المطاف تحقيق فقط 1-2% من siRNA في البداية يدخل الخلية التي تحتوي جسيمات نانوية الهروب اندوسومال الخضوع يحتمل أن تكون [رني]13،14 .
وقد وضعنا مؤخرا فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) التي أساسية محملة siRNA تتألف من جسيمات نانوية السيليكون المليئة بالثغرات، و شل دهن فوسوجينيك15. واو-بسينبس يقدم ثلاث مزايا رئيسية على أنظمة إيصال اليغنوكليوتيد التقليدية الأخرى: (1) دهن فوسوجينيك الطلاء التي تمكن الجسيمات تجاوز الالتقام وتسليم الحمولة كاملة مباشرة في السيتوبلازم الخلية (مقابل % 1-2 يتحقق بالجسيمات المبتلعة13،14) (الشكل 1)؛ (2) تحميل siRNA في بسينبس أسلحة عالية (> 20 و % مقارنة بوزن 1-15% من النظم التقليدية)15، والتي تتحلل سريعاً في السيتوبلازم (بمجرد إلقاء الجسيمات الأساسية للطلاء الدهني عن طريق امتصاص فوسوجينيك) لإطلاق سراح siRNA؛ و (3) استهداف تصريف الببتيد لاستضافة أكثر انتقائية للمطلوب أنواع الخلايا الحية في.
وقد أثبت نظام بسينب و الجينات كبيرة إسكات فعالية (> 95% في المختبر؛ > 80% المجراة في) وتأثير العلاجية اللاحقة في طراز ماوس قاتلة من الالتهاب الرئوي في المذهبة س. ؛ النتائج التي تم نشرها سابقا15. ومع ذلك، يتطلب البنية المعقدة للنظام و بسينب معالجة دقيقة وصقل الأمثل لتوليد جسيمات نانوية موحدة ومستقرة. وهكذا، والغرض من هذا العمل تقديم بروتوكول شامل، فضلا عن استراتيجيات التحسين للتوليف والروغان، ووصف واو-بسينبس لاستخدامها في إيصال المستهدفة من سيرناس لتأثير إسكات الجينات القوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد توليف لجسيمات نانوية مسامية السليكون في الشكل 5. الخطوة الحاسمة في تركيب بسينبس فوسوجينيك في تحميل الخطوة (الخطوة 3). إذا كان يتم تجميع جسيمات نانوية فوسوجينيك بعد توليف (الشكل 3)، والسبب قد يكون بسبب ما يلي: (1) كلوريد الكالسيوم المخزون لم يعد المتجانس، و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل معتمد من قبل “المعاهد الوطنية للصحة” عن طريق التعاقد # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
