Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western Blot algılamak ve doku homogenates veya özleri içeren protein ifadeler ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Yıllar içinde bu teknik temel ve klinik araştırmalarda birçok gelişmeler bu bir tanı aracı hastalık^1,2varlığı tanımlamak için kullanıldığı yerler yol açmıştır. Western Blot ilk 1979 yılında proteinler polyacrylamide jeller nitroselüloz sayfalara aktarmak ve daha sonra proteinler radioactively etiketli ya da floresein için Birleşik ikincil antikorlar kullanarak görselleştirmek için bir yöntem olarak tanımlanmıştır veya peroksidaz³. Piyasada kitleri ve ekipman geliştirilmesi yoluyla, Western Blot yöntemlerinin edilmiş giderek standart ve yıllar içinde Basitleştirilmiş. Gerçekten de, teknik artık kolayca farklı arka plan ve deneyim düzeylerini ile bilim adamları tarafından yapılmaktadır. Ancak, birçok benzer deneysel teknikleri olduğu gibi Western blot analizleri sonucu kolayca tasarım ve deney yürütülmesi açısından yapılan seçimler etkilenmiştir. Bu nedenle, standart Western Blot yöntemlerinin erişilebilirliğini dikkatli deneysel planlama gereğini karanlık değil ve tasarım önemlidir. Deneysel konuları içerir, ancak sınırlı için örnek hazırlama ve işleme, seçim ve antikor protein algılama için doğrulama ve jel membran transfer verimi özellikle küçük veya büyük değildir ( 140 kDa) proteinler^4,5,6,7,8,9. Orijinal örnek protein kalitesini sonraki Western blot analizi sonucu belirlemede önemli bir rol oynar. Protein-ebilmek var olmak hulâsa çok çeşitli örnekleri ve hücre hatları, hayvan modelleri dokulardan ve öldükten sonra insan dokular, birçok kaynaktan gibi tutarlılık işleme ve işlem tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Uzun süreli depolama örnekleri protein çıkarılması için gerekli olduğunda, örneğin, protein-80 ° C’de genellikle istikrarlı olmasına rağmen protein istikrar ayıklanan proteinler ve-80 ° C’de sağlam dokular arasındaki farklılıkları olup olmadığını, önemli bildirilen¹⁰. Ayrıca, protein miktarları tekrarlanabilir tahminleri elde etmek için tutarlı homojenizasyon örneklerin çok önemlidir. Farklı lizis arabellekleri ve homojenizasyon yöntemleri (otomatik yöntemlerine göre Örneğin, el ile homojenizasyon) en iyi duruma getirme büyük ölçekli bir nicel deney başlamadan önce gerekli.

Normalleştirme stratejileri için protein yükleme ve miktar değişkenlik düzeltmek için sağlam, nicel protein ifadenin sonuçlarını elde etmek için gereklidir. β-aktin gibi proteinler kat Hizmetleri tübülin α, β-tübülin ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) geleneksel olarak protein düzeyleri için miktar normalleştirmek için kullanılmaktadır. Ancak, belirli temizlik proteinlere miktar amaçlar için normalleştirme giderek son birkaç yıl^11,12eleştirilmiştir. Ifade temizlik proteinlerin dokuları aynı hayvan⁴ve çeşitli hastalık koşulları^{4,15 arasında farklı gelişim aşamalarında13,14arasında Örneğin, değiştirebilirsiniz ,16,17}. Bu nedenle, belirli temizlik proteinler arasında farklı dokular, farklı timepoints ve deneysel koşullar değişen altında ifadeden protein daha karmaşık karşılaştırmalar yapma olanaklarını kısıtlar. Temizlik proteinler için protein varyasyon yükleme denetimine alternatif bir toplam protein leke (TPS) bu etiketleri kullanılır ve tüm proteinler bir örnek mevcut görüntüler. Belirli bir protein seviyeleri ve bu nedenle miktar TPS sinyal karşılaştırılabilir ve deneysel durumu, örnek türü veya gelişimsel timepoint bağımsız olarak tekrarlanabilir olmalıdır yerine TPS toplam protein yüküne göre sinyal normalleştirme sağlar . Ponceau S, leke içermeyen jeller, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo siyah ve Cy5 (ref. 18 gözden) toplam protein lekeleri örnekleridir. Bu yöntemlerin her biri belirli avantajları ve sınırlamalar vardır ve deneysel kurulum^4,18yanı sıra zaman ve araçlarını yöntemi seçimi bağlıdır.

Membran içinde yükleme ve miktar değişkenliği için düzeltmek için bir TPS kullanmanın yanı sıra, örnekleri arasında özellikle büyük ölçekli protein ifade analizi yaparken farklı membranlar, karşılaştırmak gerekli olabilir. Ancak, verimlilik ve toplam protein leke yoğunluğu bağlama antikor gibi faktörler değişkenliği daha fazla ayrı jeller üzerinde analiz protein örnekleri ve membranlar arasında değişkenlik tanıştırayım. Bu durumda sağlam miktar için bu nedenle membran arasındaki değişkenliği için hesabınıza bir normalleştirme adım tanıtmak gereklidir. Bu bir iç yükleme standart deneyler arasında sabit tutulur ayrı ayrı analiz membranlar tümünde ekleyerek elde edilebilir. Bu standart herhangi bir protein bu denemede dahil tüm membranlar arasında kullanılmak üzere yeterli miktarda elde edilebilir lysate şeklinde alabilir. Burada, bir lysate (5 gün eski kontrol fare elde edilen) fare beynin beyin kolayca homojenize ve lysate elde edilen protein yüksek, protein önemli bir miktarda içerir gibi kullanırız. Nüsha bir iç standart yükleme örnekleri normalleştirilmiş ve doğrudan göre ayrı membranlar sağlar.

Burada, biz bize farklı doku, fare modelleri (Hastalık modelleri de dahil olmak üzere) ve gelişimsel timepoints¹⁹arasında protein ifade varyasyon karmaşık karşılaştırmalar üstlenmek izin vermek için hazırladığımız detaylı bir iletişim kuralı tanımlamak. Bir floresan TPS bir iç yükleme standart kullanımı ile birleştirerek, biz örnekleri ve içinde tek bir deney karşılaştırılabilir deneysel koşullar, varolan kısıtlamaları aşmak başardık. Bu yaklaşım böylece araştırmacılar protein ifade farklı doku ve örnekleri arasında daha iyi keşfetmek izin veren geleneksel Western blot tekniklerin kullanılması genişletir.