Robuste comparaison des niveaux de protéine tissus et partout ailleurs au développement aide à éponger occidental quantitatives standardisées

Western Blot est une technique qui est couramment utilisée pour détecter et quantifier l’expression de la protéine, y compris dans des homogénats de tissu ou des extraits. Au cours des années, cette technique a abouti à plusieurs avancées en recherche fondamentale et clinique, où il peut être utilisé comme un outil de diagnostic pour identifier la présence de la maladie^1,2. Western Blot a été décrite en 1979 comme une méthode pour transférer des protéines de gels de polyacrylamide aux feuilles de nitrocellulose et ensuite visualiser les protéines à l’aide d’anticorps secondaires qui ont été étiquetés ou conjugués à la fluorescéine radiologiquement ou³de la peroxydase. Grâce au développement de kits disponibles dans le commerce et équipement, Western Blot méthodes ont été plus en plus standardisés et simplifiés au fil des ans. En effet, la technique est désormais facilement effectuée par des scientifiques avec des arrière-plans et des niveaux d’expérience. Cependant, comme avec beaucoup de techniques expérimentales semblables, les résultats des analyses de Western blot sont influençable par les choix opérés dans la conception et la réalisation de l’expérience. Il est important, par conséquent, que l’accessibilité des méthodes normalisées de buvard occidentales ne pas occulter la nécessité d’une planification minutieuse et expérimentale et de conception. Considérations expérimentales incluent, sans s’y limite, l’échantillon de préparation et manipulation, sélection et validation des anticorps pour la détection de la protéine et l’efficacité de transfert gel-à-membrane de particulièrement petits ou grands ( 140 kDa) protéines^4,5,6,7,8,9. La qualité des protéines de l’échantillon original joue un rôle important en déterminant les résultats de l’analyse ultérieure de Western blot. Comme protéine peut être extraites d’une grande variété d’échantillons et de sources, y compris les lignées cellulaires, des tissus de modèles animaux et post-mortem des tissus humains, cohérence dans le traitement et la manipulation est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. Par exemple, lors de l’entreposage à long terme des échantillons pour l’extraction de la protéine est nécessaire, il est important de réaliser que, même si la protéine est généralement stable à-80 ° C, des différences dans la stabilité des protéines entre les protéines extraites et de tissus intacts à-80 ° C ont été déclarés¹⁰. En outre, pour obtenir des estimations reproductibles des quantités de protéines, compatible homogénéisation des échantillons est cruciale. Optimisation des mémoires tampons de lysis différents et des méthodes d’homogénéisation (p. ex., manuelle homogénéisation par rapport aux méthodes automatisées) peut être nécessaire avant de commencer une expérience quantitative à grande échelle.

Stratégies de normalisation pour corriger la variabilité de chargement et de quantification de protéines sont essentielles pour obtenir des résultats robustes, quantitatives de l’expression de la protéine. Ménage de protéines comme la β-actine, tubuline α, β-tubuline et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ont traditionnellement servis à normaliser le taux de protéines pour la quantification. Toutefois, normalisation aux protéines internes spécifiques à des fins de quantification a été critiquée de plus en plus sur les dernières quelques années^11,12. Par exemple, l’expression des protéines de l’entretien ménager peut changer à travers différentes étapes du développement^13,14, à travers les tissus de l’ animal même⁴et en vertu de diverses maladies conditions^{4,15 ,16,17}. Par conséquent, l’utilisation des protéines internes spécifiques limite les possibilités de faire des comparaisons plus complexes entre l’expression de la protéine de différents tissus, à des intervalles différents et dans différentes conditions expérimentales. Une alternative aux protéines internes au contrôle pour protéine variation de chargement est l’utilisation d’une tache de protéines totales (TPS) cette terminologie et visualise toutes les protéines présentes dans un échantillon. TPS permet la normalisation signal selon charge de protéine totale plutôt que de niveaux d’une protéine spécifique et, par conséquent, la quantification du signal de la TPS devraient être comparables et reproductibles, quelles que soient les conditions expérimentales, le type d’échantillon ou validant du développement . Exemples de taches de protéines totales Ponceau S, gels sans tache, R-350 bleu de Coomassie, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black et Cy5 (examinées par réf. 18). Chacune de ces méthodes a des limites et des avantages spécifiques et sélection de la méthode dépend de l’heure et outils disponibles ainsi que le montage expérimental^4,18.

En plus d’utiliser un TPS pour corriger la charge au sein de la membrane et de la variabilité de la quantification, il peut être nécessaire de comparer les échantillons entre les différentes membranes, notamment lorsque vous effectuez l’analyse de l’expression des protéines à grande échelle. Cependant, la variabilité des facteurs tels que l’anticorps lie l’intensité de coloration de protéine efficacité et total peut introduire de nouvelles variabilité entre les échantillons de protéines qui sont analysées sur les gels distincts et membranes. Pour la quantification fiable dans cette situation, il est donc nécessaire d’introduire une nouvelle étape de normalisation pour tenir compte de la variabilité entre les membranes. Ceci peut être réalisé en incluant une norme interne chargement sur chacun des membranes qui est maintenue constante à travers des expériences analysées séparément. Cette norme peut prendre la forme d’une protéine qui peut être obtenu en quantité suffisante pour être utilisé dans toutes les membranes comprises dans le test lysate. Ici, nous utilisons un lysat de cerveau de souris (obtenu à partir des souris témoins âgés de 5 jours), comme le cerveau est homogénéisé facilement et la protéine obtenue lysate contient une quantité importante de protéine à une concentration élevée. Chargement d’un étalon interne en triple exemplaire permet échantillons sur membranes distinctes pour être normalisé et comparées directement.

Nous décrivons ici un protocole détaillé que nous avons mis au point pour nous permettre d’entreprendre des comparaisons complexes des variations d’expression protéiques dans différents tissus, des modèles de souris (y compris les modèles de maladies) et développement h¹⁹. En combinant un TPS fluorescent avec l’utilisation d’une charge interne standard, nous avons été en mesure de surmonter les limites actuelles du nombre d’échantillons et des conditions expérimentales qui peuvent être comparées au sein d’une seule expérience. Cette approche élargit l’utilisation de techniques traditionnelles de Western blot, permettant ainsi aux chercheurs de mieux explorer l’expression protéique dans l’ensemble des échantillons et les différents tissus.