Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie, met inbegrip in weefsel homogenates of extracten. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek, waar het kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma te identificeren van de aanwezigheid van ziekte^1,2. Westelijke bevlekken werd het eerst beschreven in 1979 als een methode voor het overbrengen van eiwitten van polyacrylamide gels naar nitrocellulose bladen en vervolgens het visualiseren van eiwitten met behulp van secundaire antilichamen die waren ofwel radioactief gelabelde of geconjugeerd met fluoresceïne of peroxidase³. Door de ontwikkeling van commercieel beschikbare kits en apparatuur, zijn westelijke bevlekkende methoden steeds meer gestandaardiseerd en vereenvoudigd door de jaren heen. Inderdaad, de techniek is gemakkelijk nu uitgevoerd door wetenschappers met uiteenlopende achtergronden en niveaus van ervaring. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Het is daarom belangrijk, dat de toegankelijkheid van gestandaardiseerde westelijke bevlekkende methoden niet de behoefte aan zorgvuldige experimentele planning verdoezelen en ontwerp. Experimentele aspecten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, monster voorbereiding en behandeling, selectie en validatie van antilichamen voor eiwit detectie en gel-naar-membraan spuitrendement van met name kleine of grote ( 140 kDa) eiwitten^4,5,6,7,8,9. Eiwit kwaliteit van het oorspronkelijke monster speelt een belangrijke rol bij de bepaling van het resultaat van de daaropvolgende westelijke vlekkenanalyse. Zoals eiwitten kan worden geëxtraheerd uit een grote verscheidenheid van monsters en bronnen, met inbegrip van weefsels van dierlijke modellen, cellijnen en post mortem menselijke weefsels, is consistentie in afhandeling en verwerking vereist om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als de langetermijnopslag van monsters voor eiwit extractie vereist is, is het belangrijk om te beseffen dat, hoewel eiwit over het algemeen stabiel bij-80 ° C is, verschillen in eiwitstabiliteit uitgepakte eiwitten en intact weefsels bij-80 ° C geweest gerapporteerde¹⁰. Bovendien, met het oog op een reproduceerbare ramingen van de hoeveelheden eiwit, consistente homogenisering van de monsters is cruciaal. Optimaliseren van verschillende lysis buffers en homogenisering methoden (bijvoorbeeld handmatige homogenisering in vergelijking met geautomatiseerde methoden) kan nodig zijn voordat u begint een grootschalige kwantitatieve experiment.

Normalisatie strategieën om te corrigeren voor eiwit laden en kwantificering variabiliteit zijn essentieel voor het verkrijgen van robuuste, kwantitatieve resultaten van eiwit expressie. Huishouden eiwitten zoals β-actine, α-tubuline, β-tubuline en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering. Echter, normalisatie aan specifieke huishouding eiwitten voor kwantificering doeleinden is steeds meer bekritiseerd over de afgelopen paar jaar^11,12. Bijvoorbeeld, kunt de uitdrukking van de huishouding eiwitten wijzigen in verschillende ontwikkelingsstadia^13,14, over weefsels van dezelfde dieren⁴en onder verschillende ziekte voorwaarden^{4,15 ,16,17}. Daarom is het gebruik van specifieke huishouding eiwitten beperkt de mogelijkheden van het maken van meer complexe vergelijkingen tussen eiwit expressie uit verschillende weefsels, op verschillende tijdstippen en onder verschillende experimentele omstandigheden. Een alternatief voor huishouden eiwitten aan besturingselement voor eiwit laden variatie is het gebruik van een totale proteïne vlek (TPS) dat etiketten en visualiseert alle eiwitten aanwezig in een monster. TPS kunt signaal normalisering op basis van de totale proteïne laden in plaats van de niveaus van één specifieke proteïne en dus kwantificering van TPS signaal moet zijn vergelijkbaar en reproduceerbare ongeacht de experimentele conditie, monster type of developmental timepoint . Voorbeelden van totaal eiwit vlekken zijn Ponceau S, vlek-vrij gels Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black en Cy5 (herzien in ref. 18). Elk van deze methoden heeft specifieke voordelen en beperkingen en selectie methode hangt af van de tijd en hulpmiddelen beschikbaar, evenals de experimentele opzet^4,18.

Naast het gebruik van een TPS om te corrigeren voor binnen-membraan laden en kwantificering variabiliteit, wellicht te vergelijken tussen verschillende membranen, met name bij het uitvoeren van grootschalige eiwit expressie analyse monsters. Echter kan variabiliteit in factoren zoals antilichamen bindende efficiëntie en totaal eiwit vlek intensiteit leiden tot verdere variabiliteit tussen de eiwitsteekproeven die op aparte gels zijn geanalyseerd en membranen. Voor robuuste kwantificering in deze situatie moet het dan ook om een verdere normalisatie stap om de variabiliteit tussen-membraan te verklaren. Dit kan worden bereikt door een interne laden standaard op elk van de afzonderlijk geanalyseerde membranen die constant wordt gehouden over experimenten. Deze standaard kan de vorm aannemen van een eiwit lysate die in voldoende hoeveelheden worden gebruikt in alle membranen opgenomen in het experiment kan worden verkregen. Hier, gebruiken we een lysate van muis hersenen (verkregen uit 5 dag oud besturingselement muizen), omdat de hersenen is gemakkelijk gehomogeniseerd en de verkregen eiwit lysate bevat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit met een hoge concentratie. Laden van een interne standaard in drievoud kunt monsters op aparte membranen worden genormaliseerd en vergeleken rechtstreeks.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints¹⁹. Door een fluorescerende TPS te combineren met het gebruik van een interne laden standaard, konden we bestaande beperkingen in het aantal monsters en experimentele omstandigheden die binnen een enkele experiment kunnen worden vergeleken. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.