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Abstract
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Immunology and Infection

Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Este artículo describe dos métodos para cuantificar las respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana después de la exposición a los impulsores inmunes: la ráfaga oxidativa transitoria y la inhibición del crecimiento de la plántula.

Abstract

Las plantas han desarrollado un sistema inmunitario robusto para percibir patógenos y protegerse contra las enfermedades. Este artículo describe dos ensayos que se pueden utilizar para medir la fuerza de la activación inmune en Arabidopsis thaliana después del tratamiento con moléculas de eliitor. Presentado primero es un método para capturar la ráfaga oxidativa dinámica y inducida rápidamente, que se puede monitorear usando un ensayo a base de luminol. El segundo presentado es un método que describe cómo medir la inhibición inducida por el inmune del crecimiento de las plántulas. Estos protocolos son rápidos y confiables, no requieren capacitación especializada o equipo, y se utilizan ampliamente para entender la base genética de la inmunidad de las plantas.

Introduction

Para percibir y defenderse de patógenos, las plantas han evolucionado receptores de reconocimiento de patrones ligados a la membrana (PRR) que detectan moléculas microbianas conservadas fuera de la célula conocida como patrones moleculares asociados a microbios (MMP)1. La unión de los MAPP a sus PRR cognados inicia la señalización inmunemediada por proteínas quinasa, lo que da como resultado una resistencia a las enfermedades de amplio espectro 2. Una de las primeras respuestas después de la activación de PRR es la fosforilación y activación de proteínas de membrana plasmática integral RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalizan la producción de especies de oxígeno reactivo extracelular (ROS)3 , 4. ROS desempeña un papel importante en el establecimiento de la resistencia a la enfermedad, actuando tanto como mensajeros secundarios para propagar la señalización inmune como agentes antimicrobianos directos5. La primera observación de una ráfaga oxidativa inmune provocada se describió utilizando tubérculos de patata de cv. Rishiri después de la inoculación de Phytophthora infestans 6. La producción de ROS se ha evaluadoen varias especies vegetales utilizando discos de hojas 7, cultivos de suspensión celular8y protoplastias6. Aquí se describe un método simple para la determinación de la producción de ROS activada por patrones en discos de hojas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Como respuesta a la percepción de MAMP, las proteínas RBOH activadas catalizan la producción de radicales de superóxido (O2–), radicales hidroxilo (•OH) y oxígeno singlete (1O2) que se convierten en peróxido de hidrógeno (H2O 2) en el espacio extracelular9. H2O2 se puede cuantificar mediante quimioluminiscencia a base de luminol en presencia del agente oxidante de peroxidasa de rábano picante (HRP)10. HRP oxida H2O2 generando un ion hidróxido (OH)y gas oxígeno (O2) que reaccionan con luminol para producir un intermedio inestable que libera un fotón de luz10. La emisión de fotones se puede cuantificar como unidades de luz relativa (RPU) utilizando un lector de microplacas o un imager capaz de detectar luminiscencia, que se han convertido en piezas estándar de equipos en la mayoría de los laboratorios moleculares. Mediante la medición de la luz producida en un intervalo de 40-60 minutos, se puede detectar una ráfaga oxidativa transitoria tan pronto como 2-5 minutos después del tratamiento del elicitor, alcanzando un máximo de 10-20 minutos y volviendo a los niveles basales después de 60 minutos11. La luz acumulativa producida a lo largo de este tiempo puede utilizarse como medida de la fuerza inmune correspondiente a la activación de las proteínas RBOH12. Convenientemente, este ensayo no requiere equipo especializado o preparación de muestras engorrosa.

Alcanzando el pico poco después de la detección de MAMP, la ráfaga oxidativa se considera una respuesta inmune temprana, junto con la activación mapK y la producción de etileno5. Las respuestas inmunitarias posteriores incluyen la reprogramación transcripcional, el cierre estomatal y la deposición de callosa2,5. La exposición prolongada a los MamPS activa continuamente la señalización inmune energéticamente costosa que resulta en la inhibición del crecimiento de las plantas, indicando un equilibrio entre el desarrollo y la inmunidad13. La inhibición del crecimiento de las plántulas activada por patrones (SGI) se utiliza ampliamente para evaluar la producción inmunitaria en Arabidopsis y ha sido parte integral de la identificación de varios componentes clave de la señalización inmune, incluidos los PRR14,15 ,16. Por lo tanto, este artículo presenta además un ensayo para SGI activado por patrón en Arabidopsis,por el cual las plántulas se cultivan en placas multipocillos que contienen medios estándar o medios complementados con un elicitor inmune durante 8-12 días y luego se pesan utilizando una escala analítica.

Para demostrar cómo se pueden utilizar los ensayos ROS y SGI para monitorear la señalización mediada por PRR, se eligieron tres genotipos que representan diferentes salidas inmunitarias: (1) el tipo salvaje Arabidopsis adhesión Columbia (Col-0), (2) el bak1-5 dominante-negativo mutante en el que el coreceptor multifuncional PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) no es funcional en la señalización inmune17,18,y (3) el mutante recesivo cpk28-1, que carece de la proteína reguladora CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) y muestra respuestas inmunitarias activadas19,20. Los ensayos ROS y SGI se presentan en respuesta a un epítopo de péptido elf18 producido sintéticamente de Factor de elongación bacteriano Tu (EF-Tu), reconocido en Arabidopsis por el PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Estos protocolos se pueden utilizar con otros eliitores inmunes como la proteína de motilidad bacteriana flagelina14 o las proteínas endógenas del elicitor vegetal (AtPeps)16, sin embargo, debe tenerse en cuenta que la capacidad de respuesta de la planta difiere dependiendo de la elicitor21. Juntos, los ensayos ROS y SGI se pueden utilizar para la evaluación rápida y cuantitativa de las respuestas mediadas por PRR tempranas y tardías.

Protocol

1. Detección de ráfaga de ROS en los discos de la hoja de Arabidopsis después de la elicitation inmune Crecimiento y mantenimiento de la planta. Para sincronizar la germinación, estratificar las semillas de Arabidopsis suspendiendo aproximadamente 50 semillas en 1 ml de agar estéril 0.1% [w/v] y almacenar a 4oC (sin luz) durante 3-4 días.NOTA: Estratifica ralentí un control de fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) y genotipos con salidas inmunes altas y bajas (por ejemp…

Representative Results

Mutantes cpk28-119,25 y bak1-517,se utilizaron18 plantas para demostrar los resultados esperados para los genotipos con respuestas inmunitarias altas y bajas, respectivamente, en ráfaga oxidativa y SGI ensayos relativos a un control de fondo de tipo salvaje (Col-0). Para evaluar los efectos dependientes de la dosis, se utilizó una serie de dilución de …

Discussion

Este artículo describe dos métodos para evaluar las respuestas inmunitarias activadas por patrones en Arabidopsis,ofreciendo enfoques cuantitativos para evaluar la producción inmune sin el uso de equipos especializados. En combinación, ROS y SGI activados por patrones se pueden utilizar para evaluar las respuestas tempranas y tardías a la percepción de los microbios, respectivamente.

La principal limitación del ensayo de ráfaga oxidativa es la variabilidad. Por razones que no …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo en nuestro laboratorio se financia a través del Programa de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Recursos Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), el Fondo de Líderes John R. Evans de la Fundación Canadiense para la Innovación y la Universidad de Queen. KS e IS cuentan con el apoyo de becas de posgrado en tándem Ontario y becas de posgrado NSERC Canadá para estudiantes de maestría (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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