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Abstract
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Immunology and Infection

Modellazione-Triggered Ossidative Burst e Seedling Growth Assays in Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Questo documento descrive due metodi per quantificare le risposte della difesa nell’Arabidopsis thaliana in seguito all’esposizione agli elicitori immunitari: il scoppio ossidativo transitorio e l’inibizione della crescita delle piantine.

Abstract

Le piante hanno sviluppato un robusto sistema immunitario per percepire gli agenti patogeni e proteggere dalle malattie. Questo documento descrive due saggi che possono essere utilizzati per misurare la forza dell’attivazione immunitaria in Arabidopsis thaliana dopo il trattamento con molecole di elicitor. Presentato per primo è un metodo per catturare la raffica ossidativa rapida e dinamica, che può essere monitorata utilizzando un saggio basato sul luminol. Il secondo è presentato come misurare l’inibizione indotta immunoindotta della crescita delle piantine. Questi protocolli sono veloci e affidabili, non richiedono formazione o attrezzature specializzate e sono ampiamente utilizzati per comprendere la base genetica dell’immunità delle piante.

Introduction

Per percepire e difendersi dagli agenti patogeni, le piante hanno sviluppato recettori di riconoscimento dei modelli legati alla membrana (PRR) che rilevano molecole microbiche conservate al di fuori della cellula note come modelli molecolari associati ai microbi (MAMP)1. Il legame dei MAMP ai loro MR cognati avvia la segnalazione immunitaria mediata dalla chinasi proteica, con conseguente resistenza alle malattie ad ampio spettro2. Una delle prime risposte dopo l’attivazione del PRR è la fosforolalazione e l’attivazione delle proteine respiratorie RESPIRATORI OXIDASE HOMOLOG (RBOH) che catalizzano la produzione di specie extracellulari reattive dell’ossigeno (ROS)3 , 4. Il ROS svolge un ruolo importante nello stabilire la resistenza alle malattie, agendo sia come messaggeri secondari per propagare la segnalazione immunitaria sia come agenti antimicrobici diretti5. La prima osservazione di un’esplosione ossidativa immuno-elitata è stata descritta usando tuberi di patate di cv. Rishiri dopo Phytophthora infestans inoculazione6. La produzione di ROS è stata valutata in diverse specie vegetali utilizzando dischi foglia7, colture di sospensioni cellulari8e protoplasts6. Descritto qui è un metodo semplice per andire la produzione ROS innescata da pattern nei dischi foglia dell’Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

In risposta alla percezione del MAMP, le proteine RBOH attivate catalizzano la produzione di radicali di superossido (O2–), radicali idrossili (OH) e ossigeno singlet (1O2) che vengono convertiti in perossido di idrogeno (H2O 2) nello spazio extracellulare9. H2O2 può essere quantificato dalla chemiluminescenza a base di luminolo in presenza dell’agente ossidante perossidase (HRP)10. HRP ossida H2O2 generando uno ione idrossido (OH)e gas di ossigeno (O2) che reagiscono con il luminol per produrre un intermedio instabile che rilascia un fotone di luce10. L’emissione di fotoni può essere quantificata come unità di luce relativa (RLU) utilizzando un lettore di microplacino o un imager in grado di rilevare la luminescenza, che sono diventati pezzi standard di attrezzature nella maggior parte dei laboratori molecolari. Misurando la luce prodotta in un intervallo di 40-60 minuti, un’esplosione ossidativa transitoria può essere rilevata già 2-5 minuti dopo il trattamento dell’elicitor, raggiungendo il picco di 10-20 minuti e tornando a livelli basali dopo 60 minuti11. La luce cumulativa prodotta in questo ciclo temporale può essere utilizzata come misura della forza immunitaria corrispondente all’attivazione delle proteine RBOH12. Convenientemente, questo saggio non richiede attrezzature specializzate o preparazione ingombrante del campione.

Raggiungendo il picco poco dopo il rilevamento MAMP, il scoppio ossidativo è considerato una risposta immunitaria precoce, insieme all’attivazione MAPK e alla produzione di etilene5. Le successive risposte immunitarie includono la riprogrammazione trascrizionale, la chiusura stomatale e la deposizione callosa2,5. L’esposizione prolungata ai MAMP attiva continuamente la segnalazione immunitaria energeticamente costosa con conseguente inibizione della crescita delle piante, indicativa di un compromesso tra sviluppo e immunità13. L’inibizione della crescita delle piantine innescata a pattern (SGI) è ampiamente utilizzata per valutare la produzione immunitaria in Arabidopsis ed è stata parte integrante dell’identificazione di diversi componenti chiave della segnalazione immunitaria, tra cui i PRR14,15 ,16. Pertanto, questo documento presenta inoltre un saggio per la SGI innescata a motivi geometrici in Arabidopsis, in base al quale le piantine vengono coltivate in piastre multi-bene contenenti supporti standard o multimediali integrati con un elicitor immunitario per 8-12 giorni e poi pesati utilizzando una scala analitica.

Per dimostrare come i test ROS e SGI possono essere utilizzati per monitorare la segnalazione mediata da PRR, sono stati scelti tre genotipi che rappresentano output immunitarie variabili: (1) il tipo selvaggio Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) il bak1-5 dominante-negativo in cui il co-recettore multifunzionale PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) non è funzionale nella segnalazione immunitaria17,18e (3) il mutante cpk28-1 recessivo, che manca proteine regolatorie CALCIUM-dipendente PROTEIN A LIVELLO DI KINASE 28 (CPK28) e visualizza risposte potenziate19,20. I saggi ROS e SGI sono presentati in risposta a un epitopo peptide elf18 prodotto sinteticamente del fattore di allungamento batterico Tu (EF-Tu), riconosciuto in Arabidopsis dal PRR EF-Tu RECETTOR (EFR)15. Questi protocolli possono essere utilizzati con altri elicitori immunitari come la flagellina14 della proteina di motilità batterica o le proteine endogene dell’elicitora vegetale (AtPeps)16, tuttavia, va notato che la reattività delle piante differisce a seconda elicitor21. Insieme, i saggi ROS e SGI possono essere utilizzati per la valutazione rapida e quantitativa delle risposte mediate da PRR precoce e tardiva.

Protocol

1. Rilevamento di esplosione ROS nei dischi foglia di Arabidopsis dopo l’elicitazione immunitaria Crescita e manutenzione dell’impianto. Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di sterile 0,1% agar [w/v] e conservare a 4 gradi (senza luce) per 3-4 giorni.NOTA: Stratificare un controllo dello sfondo di tipo selvaggio (ad esempio, Col-0) e genotipi con uscite immunitarie alte e basse (ad esempio, cpk28-1 e b…

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 e bak1-517,18 piante sono state utilizzate per dimostrare i risultati attesi per i genotipi con risposte immunitarie alte e basse, rispettivamente, in burst ossidativo e SGI saggi relativi a un controllo di sfondo di tipo selvaggio (Col-0). Per valutare gli effetti dipendenti dalla dose, è stata utilizzata una serie di diluizione pept…

Discussion

Questo documento descrive due metodi per andire le risposte immunitarie innescate in modello in Arabidopsis, offrendo approcci quantitativi alla valutazione della produzione immunitaria senza l’uso di apparecchiature specializzate. In combinazione, ROS e SGI attivati in modello possono essere utilizzati per valutare le risposte tempestive e tardive alla percezione dei microbi, rispettivamente.

La principale limitazione del saggio ossidativo burst è la variabilità. Per motivi che non…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro nel nostro laboratorio è finanziato attraverso il Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, la Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader’s Fund e la Queen’s University. KS e IS sono supportati da borse di studio tandem Ontario Graduate e borse di studio NSERC Canada Graduate per studenti di master (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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