Summary

Riduzione delle dimensioni chirurgiche di zebrafish per lo studio della scala del modello embrionale

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Qui descriviamo un metodo per ridurre le dimensioni degli embrioni di pesce zebra senza interrompere i normali processi di sviluppo. Questa tecnica consente lo studio del ridimensionamento del modello e della robustezza dello sviluppo contro il cambiamento delle dimensioni.

Abstract

Nel processo di sviluppo, gli embrioni mostrano una notevole capacità di abbinare il loro modello corporeo alle loro dimensioni corporee; la loro proporzione corporea è mantenuta anche in embrioni che sono più grandi o più piccoli, entro certi limiti. Anche se questo fenomeno di scalatura ha attirato l’attenzione di oltre un secolo, la comprensione dei meccanismi di base è stata limitata, a causa in parte di una mancanza di descrizione quantitativa delle dinamiche evolutive in embrioni di varie dimensioni. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per ridurre chirurgicamente le dimensioni degli embrioni di pesce zebra, che hanno grandi vantaggi per l’imaging Live in vivo. Abbiamo dimostrato che dopo una rimozione equilibrata delle cellule e del tuorlo alla fase Blastula in fasi distinte, gli embrioni possono recuperare rapidamente nelle giuste condizioni e svilupparsi in embrioni più piccoli ma altrimenti normali. Poiché questa tecnica non richiede attrezzature speciali, è facilmente adattabile e può essere utilizzata per studiare una vasta gamma di problemi di ridimensionamento, inclusa la robustezza del patterning mediogeno.

Introduction

Gli scienziati hanno da tempo saputo che gli embrioni hanno una notevole capacità di formare proporzioni corporee costanti, anche se le dimensioni dell’embrione possono variare notevolmente sia in condizioni naturali che sperimentali1,2,3. Nonostante decenni di studi teorici e sperimentali, questa robustezza alla variazione dimensionale, il ridimensionamento definito, e i suoi meccanismi sottostanti rimangono sconosciuti in molti tessuti e organi. Al fine di catturare direttamente le dinamiche del sistema di sviluppo, abbiamo stabilito una tecnica di riduzione delle dimensioni riproducibile e semplice in pesce zebra4, che ha il grande vantaggio in in vivo di imaging Live5.

Zebrafish ha servito come modello di animale vertebrato per studiare diverse discipline della biologia, compresa la biologia dello sviluppo. In particolare, il pesce zebra è ideale per l’imaging Live in vivo6 perché 1) lo sviluppo può procedere normalmente al di fuori della madre e del guscio d’uovo, e 2) gli embrioni sono trasparenti. Inoltre, gli embrioni possono sopportare alcune fluttuazioni di temperatura e ambientali, che permette loro di essere studiati in condizioni di laboratorio. Inoltre, oltre alla perturbazione convenzionale dell’espressione genica per morfolino e l’iniezione di mRNA7,8, i recenti progressi nella tecnologia CRISPR/Cas9 hanno reso la genetica inversa in pesce zebra altamente efficiente9. Inoltre, molte tecniche classiche in embriologia, come il trapianto di cellule o la chirurgia tissutale possono essere applicate4,10,11.

Le tecniche di riduzione delle dimensioni sono state originariamente sviluppate in anfibi e altri animali non vertebrati12. Ad esempio, in Xenopus laevis, un altro modello popolare di animali vertebrati, la bisezione lungo l’asse animale-vegetale allo stadio Blastula può produrre embrioni di dimensioni ridotte12,13. Tuttavia, nelle nostre mani questo approccio in un solo passaggio provoca embrioni dorsalizzati o ventralizzati nel pesce zebra, presumibilmente perché i determinanti dorsali sono distribuiti in modo non uniforme e non si può conoscere la loro localizzazione dalla morfologia degli embrioni. Qui si dimostra un’alternativa tecnica di taglio a due fasi per il pesce zebra che produce embrioni normalmente in via di sviluppo ma più piccoli. Con questa tecnica, le cellule vengono prima rimosse dal palo animale, una regione di cellule ingenue prive di attività dell’organizzatore. Per bilanciare la quantità di tuorlo e cellule, che è importante per epiboly e successiva morfologenesi, il tuorlo viene quindi rimosso. Qui, dettagliamo questo protocollo e forniamo due esempi di invarianza dimensionale nella formazione del modello; la formazione di somite e il patterning del tubo neurale ventrale. In combinazione con l’imaging quantitativo, abbiamo utilizzato la tecnica di riduzione delle dimensioni per esaminare il modo in cui le dimensioni dei somiti e del tubo neurale sono influenzate in embrioni ridotti.

Protocol

Tutte le procedure relative ai pesci sono state effettuate con l’approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) presso la Harvard Medical School. 1. preparazione degli utensili e dei reagenti Fare un anello di filo per tagliare gli embrioni Prendere 20 cm di filo di acciaio inossidabile che è rigido e non corrosivo con un diametro di 40 μm. Loop il filo attraverso in vetro capillare (1,0 mm diametro est…

Representative Results

La riduzione del volume di tuorlo è importante per la morfologia normaleCome recentemente descritto in Almuedo-Castillo et al.17, la riduzione delle dimensioni degli embrioni può essere ottenuta senza ridurre il volume del tuorlo. Per confrontare con e senza riduzione del volume di tuorlo, abbiamo eseguito sia il taglio a due fasi (sia Blastula e tuorlo) che la Blastula-solo taglio (Figura 2 e film supplementare 1). Embrioni tri…

Discussion

Storicamente, tra gli animali vertebrati, la riduzione delle dimensioni è stata eseguita principalmente utilizzando embrioni anfibi, bisettrice gli embrioni lungo l’asse animale-vegetale in una Blastula fase12. Tuttavia, ci sono principalmente due differenze tra gli embrioni di rana e di pesce zebra quando si dividere gli embrioni. In primo luogo, nella fase in cui gli embrioni di pesce zebra diventano tolleranti di bisettrice (stadio Blastula), l’organizzatore si tro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato sostenuto dal programma PRESTO dell’Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia (JPMJPR11AA) e da un Istituto nazionale di salute (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

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Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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