Riduzione delle dimensioni chirurgiche di zebrafish per lo studio della scala del modello embrionale
Summary
Qui descriviamo un metodo per ridurre le dimensioni degli embrioni di pesce zebra senza interrompere i normali processi di sviluppo. Questa tecnica consente lo studio del ridimensionamento del modello e della robustezza dello sviluppo contro il cambiamento delle dimensioni.
Abstract
Nel processo di sviluppo, gli embrioni mostrano una notevole capacità di abbinare il loro modello corporeo alle loro dimensioni corporee; la loro proporzione corporea è mantenuta anche in embrioni che sono più grandi o più piccoli, entro certi limiti. Anche se questo fenomeno di scalatura ha attirato l’attenzione di oltre un secolo, la comprensione dei meccanismi di base è stata limitata, a causa in parte di una mancanza di descrizione quantitativa delle dinamiche evolutive in embrioni di varie dimensioni. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per ridurre chirurgicamente le dimensioni degli embrioni di pesce zebra, che hanno grandi vantaggi per l’imaging Live in vivo. Abbiamo dimostrato che dopo una rimozione equilibrata delle cellule e del tuorlo alla fase Blastula in fasi distinte, gli embrioni possono recuperare rapidamente nelle giuste condizioni e svilupparsi in embrioni più piccoli ma altrimenti normali. Poiché questa tecnica non richiede attrezzature speciali, è facilmente adattabile e può essere utilizzata per studiare una vasta gamma di problemi di ridimensionamento, inclusa la robustezza del patterning mediogeno.
Introduction
Gli scienziati hanno da tempo saputo che gli embrioni hanno una notevole capacità di formare proporzioni corporee costanti, anche se le dimensioni dell’embrione possono variare notevolmente sia in condizioni naturali che sperimentali1,2,3. Nonostante decenni di studi teorici e sperimentali, questa robustezza alla variazione dimensionale, il ridimensionamento definito, e i suoi meccanismi sottostanti rimangono sconosciuti in molti tessuti e organi. Al fine di catturare direttamente le dinamiche del sistema di sviluppo, abbiamo stabilito una tecnica di riduzione delle dimensioni riproducibile e semplice in pesce zebra4, che ha il grande vantaggio in in vivo di imaging Live5.
Zebrafish ha servito come modello di animale vertebrato per studiare diverse discipline della biologia, compresa la biologia dello sviluppo. In particolare, il pesce zebra è ideale per l’imaging Live in vivo6 perché 1) lo sviluppo può procedere normalmente al di fuori della madre e del guscio d’uovo, e 2) gli embrioni sono trasparenti. Inoltre, gli embrioni possono sopportare alcune fluttuazioni di temperatura e ambientali, che permette loro di essere studiati in condizioni di laboratorio. Inoltre, oltre alla perturbazione convenzionale dell’espressione genica per morfolino e l’iniezione di mRNA7,8, i recenti progressi nella tecnologia CRISPR/Cas9 hanno reso la genetica inversa in pesce zebra altamente efficiente9. Inoltre, molte tecniche classiche in embriologia, come il trapianto di cellule o la chirurgia tissutale possono essere applicate4,10,11.
Le tecniche di riduzione delle dimensioni sono state originariamente sviluppate in anfibi e altri animali non vertebrati12. Ad esempio, in Xenopus laevis, un altro modello popolare di animali vertebrati, la bisezione lungo l’asse animale-vegetale allo stadio Blastula può produrre embrioni di dimensioni ridotte12,13. Tuttavia, nelle nostre mani questo approccio in un solo passaggio provoca embrioni dorsalizzati o ventralizzati nel pesce zebra, presumibilmente perché i determinanti dorsali sono distribuiti in modo non uniforme e non si può conoscere la loro localizzazione dalla morfologia degli embrioni. Qui si dimostra un’alternativa tecnica di taglio a due fasi per il pesce zebra che produce embrioni normalmente in via di sviluppo ma più piccoli. Con questa tecnica, le cellule vengono prima rimosse dal palo animale, una regione di cellule ingenue prive di attività dell’organizzatore. Per bilanciare la quantità di tuorlo e cellule, che è importante per epiboly e successiva morfologenesi, il tuorlo viene quindi rimosso. Qui, dettagliamo questo protocollo e forniamo due esempi di invarianza dimensionale nella formazione del modello; la formazione di somite e il patterning del tubo neurale ventrale. In combinazione con l’imaging quantitativo, abbiamo utilizzato la tecnica di riduzione delle dimensioni per esaminare il modo in cui le dimensioni dei somiti e del tubo neurale sono influenzate in embrioni ridotti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Storicamente, tra gli animali vertebrati, la riduzione delle dimensioni è stata eseguita principalmente utilizzando embrioni anfibi, bisettrice gli embrioni lungo l’asse animale-vegetale in una Blastula fase12. Tuttavia, ci sono principalmente due differenze tra gli embrioni di rana e di pesce zebra quando si dividere gli embrioni. In primo luogo, nella fase in cui gli embrioni di pesce zebra diventano tolleranti di bisettrice (stadio Blastula), l’organizzatore si tro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dal programma PRESTO dell’Agenzia giapponese per la scienza e la tecnologia (JPMJPR11AA) e da un Istituto nazionale di salute (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
