Summary

Réduction chirurgicale de la taille du Zébrafish pour l’étude de l’échelle des motifs embryonnaires

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour réduire la taille des embryons de zébrafish sans perturber les processus de développement normaux. Cette technique permet d’étudier la mise à l’échelle des patrons et la robustesse du développement contre le changement de taille.

Abstract

Dans le processus de développement, les embryons montrent une capacité remarquable à assortir leur modèle corporel à leur taille corporelle; leur proportion corporelle est maintenue même chez les embryons plus grands ou plus petits, dans certaines limites. Bien que ce phénomène de mise à l’échelle ait attiré l’attention depuis plus d’un siècle, la compréhension des mécanismes sous-jacents a été limitée, en partie en raison d’un manque de description quantitative de la dynamique du développement chez les embryons de tailles variées. Pour surmonter cette limitation, nous avons développé une nouvelle technique pour réduire chirurgicalement la taille des embryons de zébrafish, qui ont de grands avantages pour l’imagerie en direct in vivo. Nous démontrons qu’après l’élimination équilibrée des cellules et du jaune au stade blastula dans des étapes distinctes, les embryons peuvent rapidement se rétablir dans les bonnes conditions et se développer en embryons plus petits mais normalement normaux. Comme cette technique ne nécessite pas d’équipement spécial, elle est facilement adaptable et peut être utilisée pour étudier un large éventail de problèmes de dimensionnement, y compris la robustesse du modelage par médiation morphogénique.

Introduction

Les scientifiques ont longtemps connu que les embryons ont une capacité remarquable à former des proportions constantes du corps bien que la taille de l’embryon peut varier grandement à la fois dans les conditions naturelles et expérimentales1,2,3. Malgré des décennies d’études théoriques et expérimentales, cette robustesse à la variation de taille, appelée mise à l’échelle, et ses mécanismes sous-jacents demeurent inconnus dans de nombreux tissus et organes. Afin de capturer directement la dynamique du système en développement, nous avons établi une technique de réduction de taille reproductible et simple dans le poisson zèbre4, qui a le grand avantage dans l’imagerie en direct in vivo5.

Le zébrafish a servi de modèle d’animal vertébré pour étudier plusieurs disciplines de la biologie, y compris la biologie du développement. En particulier, le zébrafish est idéal pour l’imagerie en direct in vivo6 parce que 1) le développement peut se dérouler normalement à l’extérieur de la mère et de la coquille d’oeuf, et 2) les embryons sont transparents. En outre, les embryons peuvent résister à certaines fluctuations de température et d’environnement, ce qui leur permet d’être étudiés dans des conditions de laboratoire. En outre, en plus de la perturbation conventionnelle d’expression génique par morpholino et l’injection de mRNA7,8, les progrès récents dans la technologie crispr/Cas9 a fait la génétique inversée dans le poisson zèbre très efficace9. En outre, de nombreuses techniques classiques en embryologie, telles que la transplantation cellulaire ou la chirurgie tissulaire peuvent être appliquées4,10,11.

Des techniques de réduction de la taille ont été développées à l’origine chez les amphibiens et autres animaux non vertébrés12. Par exemple, dans Xenopus laevis, un autre modèle animal de vertébrés populaire, la bissection le long de l’axe animal-végétal au stade blastula peut produire des embryons réduits de taille12,13. Cependant, dans nos mains cette approche en une étape entraîne des embryons dorsalisés ou ventralisés dans le zébrafish, vraisemblablement parce que les déterminants dorsales sont distribués de manière inégale et on ne peut pas connaître leur localisation de la morphologie des embryons. Nous montrons ici une technique alternative de hachage en deux étapes pour le zébrafish qui produit des embryons normalement en développement mais plus petits. Avec cette technique, les cellules sont d’abord retirées du pôle animal, une région de cellules naïves manquant dans l’activité de l’organisateur. Pour équilibrer la quantité de jaune et de cellules, ce qui est important pour l’épibolie et la morphogenèse subséquente, le jaune est ensuite enlevé. Ici, nous détaillons ce protocole et fournissons deux exemples d’invariance de taille dans la formation de modèle; formation de somite et le modelage du tube neural ventrale. Combinée à l’imagerie quantitative, nous avons utilisé la technique de réduction de la taille pour examiner la façon dont les tailles des somites et du tube neural sont affectées par la taille des embryons réduits.

Protocol

Toutes les procédures liées au poisson ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Harvard Medical School. 1. préparation des outils et des réactifs Faire une boucle de fil pour hacher les embryons Prendre 20 cm de fil d’acier inoxydable rigide et non corrosif d’un diamètre de 40 μm. Boucler le fil dans le capillaire en verre (diamètre extérieur de 1…

Representative Results

La réduction du volume du jaune est importante pour la morphologie normaleComme nous l’avons récemment décrit dans Almuedo-Castillo et al.17, la réduction de la taille des embryons peut être obtenue sans réduire le volume du jaune. Pour comparer avec et sans réduction du volume du jaune, nous avons effectué deux étapes de hachage (blastula et jaune) et de hachage blastula seulement (figure 2 et film supplémentaire 1). …

Discussion

Historiquement, parmi les animaux vertébrés, la réduction de la taille a été principalement réalisée à l’aide d’embryons d’amphibiens, en bisayant les embryons le long de l’axe animal-végétal à une phase blastula12. Cependant, il y a principalement deux différences entre les embryons de grenouille et de zébrafish lorsque nous bisect embryons. Premièrement, au stade où les embryons de zébrafish deviennent tolérants au bisou (stade blastula), l?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux ont été soutenus par le programme PRESTO de l’Agence japonaise pour la science et la technologie (JPMJPR11AA) et un don des instituts nationaux de santé (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

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Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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