iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi
Summary
Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC’de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC’leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.
Abstract
Duchenne musküler distrofi (DMD) distrofin genimutasyonları nedeniyle ciddi bir ilerleyici kas hastalığıdır, sonuçta kas atalarının tükenmesine yol açar. Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar/CRISPR ilişkili 9 (CRISPR/Cas9) gen düzenleme distrofin geninin ekspresyonunu geri getirme potansiyeline sahiptir. Otolog indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs)-türetilmiş kas progenitor hücreleri (MPC) kök / progenitor hücre havuzu doldurmak, onarım hasarı, ve bir bağışıklık yanıtı neden olmadan DMD daha fazla komplikasyonları önlemek. Bu çalışmada, recovered distrofin protein ekspresyonu ile kas ataları elde etmek için CRISPR/Cas9 ve entegre olmayan iPSC teknolojilerinin bir kombinasyonunu sokulduk. Kısaca, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarından bir iPSC hattı oluşturmak için entegre olmayan bir Sendai vektörü kullanıyoruz. Daha sonra, yeniden çerçevelenmiş distrofin geninin homolog olmayan bir uçla distropin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanırız. 94 seçilmiş iPSC kolonisinden üç kolonide exon23 tükenmesinin PCR doğrulanmasından sonra, kas farklılaşmasının düzenlenmesinde önemli rol oynayan önemli bir transkripsiyon faktörü olan MyoD’nin doksisiklin (Dox) indüklenen ekspresyonu ile iPSC’yi MPC’ye ayırırız. Sonuçlarımız, DMD tedavisi için gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir potansiyele sahip olan iPSC kaynaklı MPC’de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 silme stratejisini kullanmanın fizibilitesini göstermektedir.
Introduction
Duchenne musküler distrofi (DMD) en sık görülen kas distrofilerinden biridir ve distrofin yokluğu ile karakterizedir, dünya çapında yaklaşık 5.000 yenidoğan erkek 1 etkileyen1. Distrofin gen fonksiyonunun kaybı ilerleyici miyofiberdejenerasyona yol açan yapısal kas defektleri ile sonuçlanır1,2. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) aracılı gen terapi sistemi, distrofin ekspresyonunu geri getirmek ve mikro-distrofinler (μ-Dys) kullanılarak gen replasmanı gibi kas fonksiyonlarını iyileştirmek için test edilmiştir. Ancak, rAAV yaklaşımı fonksiyonel protein ekspresyonunu sürdürmek için tekrarlanan enjeksiyonlar gerektirir3,4. Bu nedenle DMD’li hastalarda distrofin gen ekspresyonunu etkin ve kalıcı olarak kurtarabilecek bir stratejiye ihtiyacımız var. DMD için bir fare modeli olan Dmdmdx fare, erken sonlandırma kodonu ile sonuçlanan ve C-terminal distroglisan bağlayıcı etki alanından yoksun fonksiyonel olmayan bir kesilmiş proteinle sonuçlanan distrofin geninin ekson 23’ünde bir nokta mutasyonuna sahiptir. Son çalışmalar, küçükve büyük hayvan5,6,7doğru gen düzeltme veya mutant ekson silme ile distrofin gen ekspresyonunu geri yüklemek için CRISPR/Cas9 teknolojisinin kullanımını göstermiştir. Long ve ark.8 homoloji yönelimli onarım (HDR) tabanlı CRISPR/Cas9 genom düzenleme ile Dmdmdx fare germline disttrophin gen mutasyonu düzeltmek için yöntem bildirdi. El Refaey ve ark.9 rAAV’nin distrofik farelerde mutant ekson 23’ü verimli bir şekilde çıkarabileceğini bildirdi. Bu çalışmalarda, gRNA’lar intronlar 20 ve 23’te çift iplikli DNA kırılmalarına neden olacak şekilde tasarlanmıştır ve bu da homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla DNA onarımı sonrası distrofin ekspresyonunu kısmen düzeltmiştir. Daha da heyecan verici, Amoasii veark. 10 son zamanlarda caninmodelleri, gelecekteki klinik uygulamada önemli bir adım distrofin ekspresyonu geri rAAV aracılı CRISPR gen düzenleme etkinliğini ve fizibilite bildirdi.
DMD de kök hücre bozukluklarına neden olur11. Kas hasarı için, konut kas kök hücreleri kas farklılaşması ndan sonra ölmekte olan kas hücrelerini doldurmak. Ancak, yaralanma ve onarım ardışık döngüleri kas kök hücrelerinde telomerlerin kısaltılmasına yol12, ve kök hücre havuzlarının erken tükenmesi13,14. Bu nedenle, distrofin ekspresyonunu geri yüklemek için genom düzenleme ile otolog kök hücre tedavisinin bir kombinasyonu DMD tedavisinde pratik bir yaklaşım olabilir. CRISPR/Cas9 teknolojisi, fonksiyonel kas rejenerasyonu için genetik olarak düzeltilmiş indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSC) üretme ve immün reddedilmeye neden olmadan DMD’nin daha fazla komplikasyonunu önleme olanağı sağlar. Ancak, iPSC’lerin tümör oluşumu riski vardır, bu da iPSC’nin miyojenik progenitor hücrelere farklılaşması ile hafifletilebilir.
Bu protokolde, Dmdmdx farelerin dermal fibroblastlarının iPSC’lere yeniden programlanması ve daha sonra CRISPR/Cas9 genom deletion ile distrofin ekspresyonunun kurtarılması için sendai virüsünün entegre olmayan kullanımını açıklıyoruz. IPSC’de Exon23 deleasyonunun genotipleme ile doğrulanmasından sonra, genom düzeltilmiş iPSC’yi MyoD kaynaklı miyojenik farklılaşma yoluyla miyojenik progenitörlere (MPC) ayırdık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Duchenne Musküler Distrofi (DMD) yıkıcı ve sonuçta ölümcül kalıtsal bir hastalık distrofin eksikliği ile karakterize, ilerleyici kas atrofisi yol1,2. Sonuçlarımız, CRISPR/Cas9 aracılı ekson23 silme yaklaşımı ile Dmdmdx iPSC kaynaklı miyojenik progenitor hücrelerinde geri yüklenen distrofin gen ekspresyonunu göstermektedir. Bu yaklaşımın üç avantajı vardır.
İlk olarak, entegre olmayan bir RNA ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang ve Weintraub kısmen NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
