Технология CRISPR/Cas9 в восстановлении экспрессии дистрофинов в iPSC-производных мышечных прародителях

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является одной из наиболее распространенных мышечных дистрофий и характеризуется отсутствием дистрофина, затрагивающих 1 из примерно 5000 новорожденных мальчиков во всем мире¹. Потеря функции гена дистрофина приводит к структурным мышечным дефектам, приводяк к прогрессирующей дегенерации миофиберд^1,2. Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (rAAV)-опосредованная система генной терапии была протестирована для восстановления экспрессии дистрофина и улучшения функции мышц, таких как замена генов с помощью микро-дистрофинов (з-Дис). Тем не менее, подход rAAV требует повторных инъекций для поддержания экспрессии функционального белка^3,4. Поэтому нам нужна стратегия, которая может обеспечить эффективное и постоянное восстановление экспрессии генов дистрофинов у пациентов с DMD. Мышь Dmd^mdx, модель мыши для DMD, имеет мутацию точки в экзоне 23 гена дистрофина, который вводит преждевременное прекращение кодона и приводит к нефункциональному усеченного белка, не имеющего C-терминального дистрогликанового связующего домена. Недавние исследования показали использование технологии CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии генов дистрофина путем точной коррекции генов или удаления мутантов экзона у малых и крупных животных^5,6,7. Long et al.⁸ сообщили о методе коррекции мутации гена дистрофинов в зародыше мыши Dmd^mdx с помощью гомологического ремонта (HDR) на основе редактирования генома CRISPR/Cas9. El Refaey et al.⁹ сообщили, что RAAV может эффективно акцизного мутанта экзона 23 у дистрофических мышей. В этих исследованиях, gRNAs были разработаны в интронах 20 и 23, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК, которые частично восстановили экспрессию дистрофина после восстановления ДНК через негомологический конец соединения (NHEJ). Еще более захватывающим, Amoasii et al.¹⁰ недавно сообщили об эффективности и осуществимости редактирования генов rAAV CRISPR в восстановлении экспрессии дистрофина в собачьих моделях, что является важным шагом в будущем клиническом применении.

DMD также вызывает нарушения стволовых клеток¹¹. Для повреждения мышц, жилые стволовые клетки мышц пополнить умирающих мышечных клеток после дифференциации мышц. Однако последовательные циклы травм и ремонта приводят к сокращению теломер в мышечных стволовых клетках^12,а преждевременное истощение пулов стволовых клеток^13,14. Таким образом, сочетание аутологичной терапии стволовыми клетками с редактированием генома для восстановления экспрессии дистрофина может быть практическим подходом для лечения ДМД. Технология CRISPR/Cas9 предоставляет возможность генерации аутологичной генетически исправленной пурипотентной пурипотентной реакции (iPSC) для функциональной регенерации мышц и предотвращения дальнейших осложнений DMD, не вызывая иммунного отторжения. Тем не менее, iPSCs имеют риск образования опухоли, которые могут быть смягчены дифференциации iPSC в миогенных клеток-прародителей.

В этом протоколе мы описываем использование неинтегрирующего вируса Сендай для перепрограммирования дермальных фибробластов мышей Dmd^mdx в iPSCs, а затем восстановления экспрессии дистрофина путем удаления генома CRISPR/Cas9. После проверки удаления Exon23 в iPSC путем генотипирования, мы дифференцировали геном-исправлено iPSC в миогенных прародителей (MPC) через MyoD-индуцированной миогенной дифференциации.