iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、最も一般的な筋ジストロフィーの一つであり、ジストロフィンの不在によって特徴付けられており、世界中の約5,000人の新生児の1人に影響を与^える。ジストロフィン遺伝子機能の喪失は、進行性筋線維変^性1、2につながる構造的な筋肉欠損をもたらす。組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)媒介遺伝子治療システムは、ジストロフィン発現を回復させ、マイクロジストロフィン(μ-Dys)を用いて遺伝子置換などの筋肉機能を改善するために試験された。しかしながら、rAAVアプローチは、機能性タンパク^質3、4の発現を維持するために繰り返し注射を必要^とする。したがって、DMD患者においてジストロフィン遺伝子発現を効果的かつ永続的に回復できる戦略が必要である。DMDのマウスモデルであるDmd^mdxマウスは、早期終了コドンを導入するジストロフィン遺伝子のエキソン23に点変異を有し、C末端ジストログリカン結合ドメインを欠く非機能的切り捨てタンパク質をもたらす。最近の研究は、小・大型^{動物5、6、7}における正確な遺伝子矯正または変異性エキソン欠失によるジストロフィン遺伝子発現を回復させるCRISPR/Cas9技術の使用を実証した。Long et al.⁸は、相同性修復(HDR)ベースのCRISPR/Cas9ゲノム編集によりDmd^mdxマウス生殖細胞系におけるジストロフィン遺伝子変異を修正する方法を報告した。El Refaey et al.⁹は、rAAVがジストロフィーマウスで変異型エキソン23を効率的に排除できると報告した。これらの研究では、gRNAは、非相同末端接合(NHEJ)を介してDNA修復後にジストロフィン発現を部分的に回復させた二本鎖DNA切断を引き起こすために、イントロン20および23で設計された。さらにエキサイティングな、Amoasii et al.¹⁰は最近、イヌモデルにおけるジストロフィン発現の復元におけるrAAV媒介性CRISPR遺伝子編集の有効性と実現可能性を報告した。

DMDはまた、幹細胞^障害11を引き起こす。筋肉の損傷のために, 住宅の筋肉幹細胞は、筋肉分化後に死にかけている筋肉細胞を補充します。.しかしながら、損傷および修復の連続したサイクルは、筋^幹細胞12におけるテロメアの短縮、および幹細胞^{プール13、14}の早期枯渇につながる。したがって、自家幹細胞療法とジストロフィン発現を回復させるゲノム編集の組み合わせは、DMDを治療するための実用的なアプローチでありうたることができる。CRISPR/Cas9技術は、機能的な筋肉再生のための自己的に修正された多能性幹細胞(iPSC)を生成し、免疫拒絶反応を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐ可能性を提供します。しかし、iPSCは腫瘍形成のリスクがあり、筋原性前駆細胞へのiPSCの分化によって緩和される可能性がある。

このプロトコルでは、非統合センダイウイルスを用いてDmd^mdxマウスの真皮線維芽細胞をiPSCに再プログラミングし、CRISPR/Cas9ゲノム欠失によりジストロフィン発現を回復することを説明する。ジェノタイピングによるiPSCにおけるExon23欠失の検証後、筋染発性筋原分化によりゲノム補正iPSCを筋原性前駆体(MPC)に分化した。