CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול Cas9 מבוסס exon23 מחיקה כדי לשחזר ביטוי הדיסטרופין ב-iPSC מ Dmdmdx העכבר הנגזר פיברוהפיצוצים ולהבדיל ישירות iPSCs לתוך תאים מיוגניים מיוגנים (mpc) באמצעות ט-על מערכת ההפעלה myod.
Abstract
ניוון שרירים duchenne (DMD) היא מחלה מתקדמת חמורה שרירים נגרמת על ידי מוטציות הגן הדיסטרופין, אשר בסופו של דבר מוביל לתשישות של תאים שריר קדמון. באשכולות באופן קבוע הכולל מרווח מחדש palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) לעריכת גנים יש את הפוטנציאל לשחזר את הביטוי של הגן הדיסטרופין. אוטוולוגי המושרה תאי גזע רב-עוצמה (iPSCs)-בתאי שריר נגזר (MPC) יכול לחדש את בריכת גזע/מחולל קדמון, לתקן נזק, ולמנוע סיבוכים נוספים ב-DMD ללא גרימת תגובה חיסונית. במחקר זה, אנו מציגים שילוב של CRISPR/Cas9 ו-iPSC שאינם משולבים טכנולוגיות להשיג ושלתי שרירים עם ביטוי חלבון הדיסטרופין התאושש. בקצרה, אנו משתמשים בווקטור שאינו שילוב של סנדאי כדי ליצור קו iPSC מתוך פיברותקיעות העורי של עכברMdx dmd. לאחר מכן אנו משתמשים באסטרטגיית המחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין באמצעות הצטרפות לא הומוולוגי של גן הדיסטרופין ממוסגר מחדש. לאחר אימות PCR של exon23 דלדול בשלוש מושבות מ 94 לאסוף מושבות iPSC, אנו להבדיל iPSC לתוך MPC על ידי דוקסיציקלין (חמצון)-ביטוי המושרה של MyoD, גורם שעתוק מפתח לשחק תפקיד משמעותי בוויסות בידול שריר. התוצאות שלנו מציגות את הכדאיות של שימוש באסטרטגיית מחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין ב-iPSC-נגזר MPC, אשר יש פוטנציאל משמעותי לפיתוח טיפולים עתידיים לטיפול DMD.
Introduction
ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא אחד הdystrophies השרירים הנפוצים ביותר והוא מאופיין על ידי העדר הדיסטרופין, המשפיעים על 1 של כ 5,000 בנים יילוד ברחבי העולם1. הפסד של הדיסטרופין הפונקציה גן תוצאות פגמים שרירים מבניים המוביל ניוון מתקדם מיואיים1,2. רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV)-תיווך מערכת הריפוי גנטי נבדק כדי לשחזר את ביטוי הדיסטרופין ולשפר את תפקוד השריר, כגון החלפת גנים באמצעות מיקרו-הdystrophins (μ-Dys). עם זאת, הגישה raav מחייב זריקות חוזרות כדי לקיים את הביטוי של חלבון פונקציונלי3,4. לכן, אנחנו צריכים אסטרטגיה שיכולה לספק ביעילות ולשחזר לצמיתות הדיסטרופין ביטוי גנטי בחולים עם DMD. העכברהmdx dmd, מודל העכבר עבור dmd, יש מוטציה נקודה ב אקסון 23 של הגן הדיסטרופין המציג מוקדם הפסקת קודון ותוצאות חלבון מעוגל לא פונקציונלי חסר הדיסטרוc מסוף מחייב לתחום. מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו השימוש crispr/Cas9 טכנולוגיה כדי לשחזר ביטוי גנטי הדיסטרופין על ידי תיקון גנטי מדויק או מוטציה אקסון מחיקה של חיה קטנה וגדולה5,6,7. ארוך ואח ‘8 דיווחו על השיטה לתיקון מוטציה גן הדיסטרופין ב dmdmdx העכבר germline על ידי תיקון homology מכוון (HDR) מבוסס Crispr/Cas9 הגנום עריכה. אל-רפאי ואח ‘9 דיווח כי raav יכול ביעילות לבלו את מוטציה 23 בעכברים הדיסטרומנוונת. במחקרים אלה, gRNAs עוצבו ב introns 20 ו 23 כדי לגרום כפול נתקע DNA הפסקות, אשר שוחזר באופן חלקי את הביטוי הדיסטרופין לאחר תיקון DNA דרך הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ). אפילו יותר מרגש, אמאסיאני ואח ‘.10 דיווחו לאחרונה על יעילות והיתכנות של raav-תיווך CRISPR לערוך גנים בשחזור הביטוי הדיסטרופין במודלים כלבים, צעד חיוני ביישום קליני בעתיד.
DMD גם גורם להפרעות תא גזע11. עבור נזק שרירים, בתאי גזע שרירים מגורים לחדש תאי שריר לאחר בידול שריר. עם זאת, מחזורים רצופים של פציעה ותיקון להוביל קיצור של טלומרים בתאי גזע שריר12, ו דלדול מוקדמת של בריכות תאי גזע13,14. לכן, שילוב של טיפול אוטוולוגי בתאי גזע עם עריכת הגנום כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין יכול להיות גישה מעשית לטיפול DMD. The CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מספקת את האפשרות של יצירת אוטוולוגי גנטית מתוקן בתאי גזע המושרה pluripotent iPSC) עבור התחדשות שרירים תפקודית ולמנוע סיבוכים נוספים של DMD ללא גרימת דחייה החיסונית. עם זאת, iPSCs יש סיכון של היווצרות הגידול, אשר יכול להיות להקלה על ידי הבידול של iPSC לתוך תאים מיוגני קדמון.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש ללא שילוב וירוס סנדאי כדי לתיכנות מראש באמצעות הפנים של עכבריםMdx dmd לתוך iPSCs ולאחר מכן לשחזר ביטוי הדיסטרופין על ידי CRISPR/Cas9 הגנום מחיקה. לאחר אימות של מחיקה Exon23 ב-iPSC על ידי הגנוטיפים, אנו הבדיל מתוקן הגנום iPSC לתוך ושלתי מיוגניים (MPC) באמצעות בידול מיוגני הנגרמת על ידי MyoD.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניוון שרירים duchenne (dmd) היא מחלה תורשתית הרסנית בסופו של דבר מאופיין על ידי חוסר של הדיסטרופין, המוביל ניוון שרירים פרוגרסיבי1,2. התוצאות שלנו להפגין הדיסטרופין המשוחזר הביטוי הגן בתוך Dmdmdx ipsc-נגזר בתאי הקדמון על ידי הגישה של CRISPR/Cas9-תיווך exon23 מחיקה. לגישה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טאנג וינטרוב תמכו בחלקם על ידי NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
