CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren
Summary
Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.
Abstract
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere progressive Muskelerkrankung, die durch Mutationen im Dystrophin-Gen verursacht wird, was letztlich zur Erschöpfung der Muskelvorläuferzellen führt. Die regelmäßig interspaceed short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) Genbearbeitung hat das Potenzial, die Expression des Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Autologinduzierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) abgeleitete Muskelvorläuferzellen (MPC) können den Stamm-/Vorläuferzellpool auffüllen, Schäden reparieren und weitere Komplikationen in DMD verhindern, ohne eine Immunantwort zu verursachen. In dieser Studie führen wir eine Kombination aus CRISPR/Cas9 und nicht integrierten iPSC-Technologien ein, um Muskelvorläufer mit wiedergewonnener Dystrophin-Proteinexpression zu erhalten. Kurz gesagt, verwenden wir einen nicht integrierenden Sendai-Vektor, um eine iPSC-Linie aus dermalen Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen zu erstellen. Wir verwenden dann die CRISPR/Cas9-Löschstrategie, um die Dystrophinexpression durch eine nicht-homologe Endverbindung des regerahmten Dystrophin-Gens wiederherzustellen. Nach der PCR-Validierung der Exon23-Erschöpfung in drei Kolonien aus 94 ausgewählten iPSC-Kolonien differenzieren wir iPSC in MPC durch Doxycyclin (Dox)-induzierte Expression von MyoD, einem wichtigen Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Muskeldifferenzierung spielt. Unsere Ergebnisse zeigen die Durchführbarkeit der Verwendung der CRISPR/Cas9-Löschstrategie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleitetem MPC, die ein erhebliches Potenzial für die Entwicklung zukünftiger Therapien zur Behandlung von DMD hat.
Introduction
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten Muskeldystrophien und zeichnet sich durch das Fehlen von Dystrophin aus, von dem 1 von etwa 5.000 neugeborenen Jungen weltweit betroffen ist1. Der Verlust der Dystrophin-Genfunktion führt zu strukturellen Muskeldefekten, die zu einer progressiven Myofiberdegeneration1,2führen. Das rekombinante adenoassoziierte Virus (rAAV)-vermittelte Gentherapiesystem wurde getestet, um die Dystrophinexpression wiederherzustellen und die Muskelfunktion zu verbessern, wie z. B. Genersatz mittels Mikrodystrophine (-Dys). Der rAAV-Ansatz erfordert jedoch wiederholte Injektionen, um die Expression des funktionellen Proteins3,4aufrechtzuerhalten. Daher brauchen wir eine Strategie, die eine effektive und dauerhafte Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression bei Patienten mit DMD bietet. Die Dmdmdx Maus, ein Mausmodell für DMD, hat eine Punktmutation in exon 23 des Dystrophin-Gens, die ein vorzeitiges Beendigungscodon einführt und zu einem nicht-funktionellen abgeschnittenen Protein führt, das nicht die C-terminale dystroglygische Bindungsdomäne enthält. Jüngste Studien haben den Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophin-Genexpression durch genaue Genkorrektur oder mutierte Exon-Deletion bei kleinen und großen Tieren5,6,7gezeigt. Long et al.8 berichtete über die Methode zur Korrektur der Dystrophin-Genmutation in Dmdmdx Mauskeimbahn durch homology-directed repair (HDR) basierte CRISPR/Cas9 Genombearbeitung. El Refaey et al.9 berichteten, dass rAAV das mutierte Exon 23 bei dystrophischen Mäusen effizient verbrauchen konnte. In diesen Studien wurden gRNAs in den Introns 20 und 23 entwickelt, um doppelsträngige DNA-Brüche zu verursachen, die die Dystrophinexpression nach DNA-Reparatur über nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) teilweise wiederhergestellt haben. Noch spannender ist, dass Amoasii et al.10 kürzlich über die Wirksamkeit und Machbarkeit der rAAV-vermittelten CRISPR-Genbearbeitung bei der Wiederherstellung der Dystrophinexpression in Canine-Modellen berichtet haben, ein wesentlicher Schritt in der zukünftigen klinischen Anwendung.
DMD verursacht auch Stammzellstörungen11. Bei Muskelschäden füllen die muskuchen Muskelstammzellen nach der Muskeldifferenzierung sterbende Muskelzellen auf. Jedoch, die aufeinanderfolgenden Zyklen der Verletzung und Reparatur führen zu Verkürzung der Telomere in Muskelstammzellen12, und vorzeitige Erschöpfung der Stammzellbecken13,14. Daher kann eine Kombination aus autologer Stammzelltherapie mit Genombearbeitung zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression ein praktischer Ansatz zur Behandlung von DMD sein. Die CRISPR/Cas9-Technologie bietet die Möglichkeit, autologe genetisch korrigierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zur funktionellen Muskelregeneration zu erzeugen und weitere Komplikationen von DMD zu verhindern, ohne eine Immunabstoßung zu verursachen. IPSCs haben jedoch ein Risiko für eine Tumorbildung, die durch die Differenzierung von iPSC in myogene Vorläuferzellen gemildert werden könnte.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung des nicht integrierenden Sendai-Virus zur Umprogrammierung dermaler Fibroblasten von Dmdmdx-Mäusen in iPSCs und dann die Dystrophinexpression durch CRISPR/Cas9-Genomlöschung. Nach der Validierung der Exon23-Deletion bei iPSC durch Genotypisierung differenzierten wir genomkorrigiertes iPSC in myogene Vorläufer (MPC) über MyoD-induzierte myogene Differenzierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Duchenne Muskeldystrophie (DMD) ist eine destruktive und letztlich tödliche Erbkrankheit durch einen Mangel an Dystrophin gekennzeichnet, was zu progressiver Muskelatrophie1,2. Unsere Ergebnisse zeigen die wiederhergestellte Dystrophin-Genexpression in Dmdmdx iPSC-abgeleiteten myogenen Vorläuferzellen durch den Ansatz der CRISPR/Cas9-vermittelten Exon23-Deletion. Dieser Ansatz hat drei Vorteile.
Zunächst haben wir iPSCs a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang und Weintraub wurden teilweise von NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354 unterstützt.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
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