CRISPR/Cas9 technologie in het herstellen van Dystrofine expressie in door iPSC afgeleide spier voorlopercellen
Summary
Hier presenteren we een Cas9-gebaseerd exon23 deletie protocol om Dystrofine expressie in iPSC te herstellen van DMDMDX Mouse-afgeleide huid fibroblasten en direct ipscs te onderscheiden in myogene voorlopercellen (MPC) met behulp van het Tet-on myod activeringssysteem.
Abstract
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een ernstige progressieve spierziekte veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine gen, wat uiteindelijk leidt tot uitputting van spier voorlopercellen. Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR-geassocieerde 9 (CRISPR/Cas9) genbewerking heeft het potentieel om de uitdrukking van het Dystrofine-gen te herstellen. Autologe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)-afgeleide spier voorlopercellen (MPC) kunnen de stam-/voorloper celpool aanvullen, schade herstellen en verdere complicaties in DMD voorkomen zonder een immuunrespons te veroorzaken. In deze studie introduceren we een combinatie van CRISPR/Cas9 en niet-geïntegreerde iPSC-technologieën om spier voorlopercellen te verkrijgen met teruggewonnen Dystrofine-eiwit expressie. Kort samengevat gebruiken we een niet-integrerende Sendai-vector om een iPSC-lijn op te zetten van dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen. Vervolgens gebruiken we de crispr/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine expressie te herstellen door een niet-homologe eind verbinding van het de Dystrofine gen. Na PCR-validering van exon23 depletie in drie kolonies uit 94 geplukt iPSC-kolonies, onderscheiden we iPSC in MPC door doxycycline (Dox)-geïnduceerde expressie van MyoD, een belangrijke transcriptiefactor die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van spier differentiatie. Onze resultaten tonen de haalbaarheid van het gebruik van CRISPR/Cas9 verwijderings strategie om Dystrofine-expressie te herstellen in de met iPSC afgeleide MPC, die een significant potentieel heeft voor het ontwikkelen van toekomstige therapieën voor de behandeling van DMD.
Introduction
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een van de meest voorkomende spier dystrofieën en wordt gekenmerkt door de afwezigheid van Dystrofine, die 1 van ongeveer 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd1. Verlies van Dystrofine-genen functie resulteert in structurele spier defecten die leiden tot progressieve myovezels degeneratie1,2. Recombinant Adeno-associated virus (rAAV)-gemedieerd gentherapie systeem is getest om de Dystrofine expressie te herstellen en de spierfunctie te verbeteren, zoals het vervangen van genen met behulp van micro-dystrofines (μ-dys). De raav-benadering vereist echter herhaalde injecties om de expressie van het functionele eiwit3,4te ondersteunen. Daarom hebben we een strategie nodig die een effectief en permanent herstel van Dystrofine genexpressie kan bieden bij patiënten met DMD. De DMDMDX Mouse, een muismodel voor DMD, heeft een puntmutatie in Exon 23 van het Dystrofine gen dat een vroegtijdige beëindiging codon introduceert en resulteert in een niet-functioneel afgeknotte proteïne zonder het C-terminale dystroglycan bindings domein. Recente studies toonden het gebruik van crispr/Cas9 technologie aan om Dystrofine genexpressie te herstellen door nauwkeurige gencorrectie of Mutant Exon deletie in kleine en grote dieren5,6,7. Long et al.8 meldde de methode voor het corrigeren van de Dystrofine-genmutatie in DMDMDX -muis kiembaan door homologie-gestuurde reparatie (HDR) op basis van crispr/Cas9 genoom editing. El Refaey et al.9 meldde dat raav de Mutante Exon 23 in dystrofische muizen efficiënt kon accijns. In deze studies werden grna’s ontworpen in de Intron 20 en 23 om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te veroorzaken, die de Dystrofine-expressie gedeeltelijk herstelde na DNA-herstel via niet-homologe eindverbindende (nhej). Nog spannender, Amoasii et al.10 meldde onlangs de werkzaamheid en haalbaarheid van raav-gemedieerde crispr Gene Editing in het herstellen van Dystrofine expressie in Canine modellen, een essentiële stap in toekomstige klinische toepassing.
DMD veroorzaakt ook stamcel aandoeningen11. Voor spier schade, residentiële spier stamcellen vullen stervende spiercellen na spier differentiatie. Echter, de opeenvolgende cycli van letsel en reparatie leiden tot verkorting van telomeren in spier stamcellen12, en vroegtijdige uitputting van stamcel groepen13,14. Daarom kan een combinatie van autologe stamceltherapie met genoom bewerking om Dystrofine expressie te herstellen een praktische benadering zijn voor de behandeling van DMD. De CRISPR/Cas9 technologie biedt de mogelijkheid om autologe genetisch gecorrigeerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) te genereren voor functionele spier regeneratie en verdere complicaties van DMD te voorkomen zonder immuunafstoting te veroorzaken. Echter, iPSCs hebben een risico van tumorvorming, die kan worden verlicht door de differentiatie van iPSC in myogene voorlopercellen.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van het niet-integrerende Sendai-virus om dermale fibroblasten van DMDMDX -muizen te herprogrammeren in ipscs en vervolgens Dystrofine-expressie te herstellen door crispr/Cas9 genoom verwijdering. Na validatie van Exon23 deletie in iPSC door genotypering, we onderscheiden genoom-gecorrigeerde iPSC in myogene voor ouders (MPC) via MyoD-geïnduceerde myogenic differentiatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Duchenne spierdystrofie (DMD) is een destructieve en uiteindelijk fatale erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een gebrek aan Dystrofine, wat leidt tot progressieve spieratrofie1,2. Onze resultaten tonen de herstelde Dystrofine genexpressie in DMDMDX IPSC-afgeleide myogene voorlopercellen door de aanpak van crispr/Cas9-gemedieerde exon23 deletie. Deze aanpak heeft drie voordelen.
Eerst genereerden we iPSCs van DMD<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang en Weintraub werden deels ondersteund door NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
