Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi
Summary
Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.
Abstract
Kuduz virüsü ve aile RhabdoviridaeIçinde cins Lyssavirus diğer üye türlerini algılamak için, Pan-Lyssavirus yuvalanmış Ters transkripsiyon polimeraz zincir REAKSIYONU (Iç Içe RT-PCR) koruma altındaki bölgeyi tespit etmek için geliştirilmiştir lyssaviruses ‘in nüklizoprotein (N) geni. Yöntem Ters transkripsiyon uygular (RT) olarak viral RNA kullanarak şablon ve oligo (dT)15 ve rasgele hexamers sentezlemek için astar olarak VIRAL tamamlayıcı DNA (cDNA). Daha sonra, viral cDNA bir 845 BP N gen parçası dış astar kullanarak ilk yuvarlak PCR yükseltmek için bir şablon olarak kullanılan, ikinci tur iç içe PCR tarafından son 371 BP parçası iç astar kullanarak yükseltmek için takip. Bu yöntem, kuduz virüsleri (RABV) farklı genetik klades algılayabilir. Doğrulama, kullanarak 9.624 beyin numuneleri sekiz yerli hayvan türlerinden 10 yıl içinde klinik kuduz teşhis ve gözetim Çin, yöntemi olduğunu gösterdi 100% duyarlılık ve 99,97% özgüllüğü ile karşılaştırıldığında doğrudan floresan antikor testi (FAT), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIS) tarafından önerilen altın standart yöntemdir. Buna ek olarak, yöntem de özellikle% 15 diğer onaylı ve iki roman Lissavirüse türü hedeflenen N gen parçası yükseltmek olabilir 10 rapordaki Uluslararası komitenin taksonomi üzerinde virüslerin (ICTV) sentezlenmiş bir mimik tespiti tarafından değerlendirilir Tüm lyssaviruses, N gen plazmids. Yöntem, kuduz tanısı için FAT ‘e uygun bir alternatif sağlar ve Çin ‘in Ulusal Standardı (GB/T36789-2018) olarak onaylanmıştır.
Introduction
Kuduz, Lyssavirus1cinsi içinde virüslerin neden olduğu dünya çapında bir zoonotik hastalıktır. Lyssaviruses (aile Rhabdoviridae), beş proteini kodlayan yaklaşık 12 KB genomu olan tek negatıf telli RNA virüsleridir: N, Fosfoprotein (P), matris proteini (M), glikoprotein (G) ve büyük protein veya polimeraz (L). N geni, genetik mesafe ve antijenik desenlerin nükvendotid dizilerine dayanarak, lyssaviruses klasik kuduz virüsü (RABV) ve kuduz ile ilgili virüsler (RRV) içeren 16 türe bölünmüştür: Lagos bat Virus (LBV), Duvenhage virüsü (DUVV ), Mokola virüsü (mokv), Avrupa bat Lissavirüse 1 (eblv-1), Avrupa bat Lissavirüse 2 (eblv-2), Avustralya bat Lissavirüse (ablv), Aravan virüs (arav), Ikoma virüsü (ıkov), bokeloh bat Lissavirüse (bblv), gannoruwa bat Lissavirüse (gblv), Irkut virüsü (ırkv), Khujand virüs (khuv), Batı Kafkas bat virüs (wcbv), Shimoni bat Virus (shibv), ve Lleida bat Lissavirüse (llebv)2. Son zamanlarda, iki ek lyssaviruses tespit edilmiştir: Kotalahti bat Lissavirüse (KBLV) bir Brandt ‘s yarasa (Myotis brandtii) içinde Finlandiya ‘da 20173 ve Tayvan bat Lissavirüse (twblv) bir Japon Pipistrelle izole () izole Pipistrellus abramus) Içinde Tayvan, Çin içinde 2016 – 20174.
Tüm memeliler kuduz hassastır; Ancak, hiçbir brüt patognomonik lezyonlar veya spesifik klinik belirtiler kimlik izin verir, ve tanı sadece laboratuvarda yapılabilir5. Kuduz tanısı için en yaygın olarak kullanılan yöntem, hem kim hem de OIE5,6tarafından altın standardı olarak kabul edilen yağ şeklindedir. Yine de, FAT bozulabilir/Autolyzed beyin dokusu örnekleri üzerinde güvenilir olmayan sonuçlar üretebilir. Buna ek olarak, beyin omurilik sıvısı (CSF), tükürük ve idrar gibi biyolojik sıvı örneklerinin tahlil edilmesi için kullanılamaz, böylece büyük ölçüde ölüm öncesi tanı7‘ de istihdamını engelliyor. Alternatif konvansiyonel tanı testleri, kuduz doku kültürü enfeksiyon testi (rtcıt) ve fare aşı testi (MIT) gibi, birkaç gün gerektirir6, hızlı bir tanı gerekli olduğunda büyük bir dezavantajı.
Çeşitli moleküler tanı testleri (örn., RT-PCR tarafından viral RNA tespiti, PCR – enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil [PCR-ELıSA], situ hybridization, ve gerçek zamanlı PCR) kuduz tanısı için hızlı ve hassas teknikler olarak kullanılır8. RT-PCR artık rutin kuduz tanısı için OIS tarafından tavsiye edilir, ve bir heminested (hn) PCR tüm lyssaviruses5algılamak Için tanısal testler ve karasal hayvanlar Için aşılar RIVE Kılavuzu ‘nda açıklanmıştır. Burada bir Pan-Lissavirüse iç içe RT-PCR, hangi tüm 18 Lissavirüse türlerin spesifik ve hassas algılama sağlayan veya FAT tarafından elde aşan karşılaştırılabilir tarif. Yöntemin prensibi, cDNA ‘ya hedef RNA ‘nın (Lissavirüse N geni tarafından bulunan bölge) bir RT ‘dir ve ardından iki tur PCR ile cDNA amplifikasyonu tarafından izlenir. CDNA bir 845 BP parçası yükseltmek için dış astar ile ilk yuvarlak PCR uğrar; daha sonra, ikinci tur PCR ilk yuvarlak PCR ürünü bir 371 BP parçası iç astar ile yükseltmek için bir şablon olarak kullanır. PCR iki tur önemli ölçüde tahlil duyarlılığı artar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şu anda, rabv Çin ‘de neredeyse tüm insan ve hayvan kuduz sorumlu büyük bir Lissavirüse, yanı sıra diğer ülkelerde. Buna ek olarak, bir ıRKV varyantı ilk olarak 201210‘ da Northeast China ‘Daki Jilin eyaletinde Murina leucogaster bat ‘tan tespit edildi ve 201711‘ de Liaoning eyaletinde bir köpeğin ölümüne neden olduğu bildirilmiştir. En son, bir roman Lyssavirus, TWBLV, Ayrıca Tayvan, Çin ‘de bir Japon Pipistrelle yarasa tespit edildi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma ulusal anahtar araştırma ve geliştirme planı (Grant No. 2016YFD0500401) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31302043) tarafından destekleniyordu.
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
