Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus
Summary
Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.
Abstract
Pour détecter le virus de la rage et d’autres espèces membres du genre lyssavirus au sein de la famille des Rhabdoviridae, la réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-LYSSAVIRUS (RT-PCR imbriquée) a été développée pour détecter la région conservée du gène nucléoprotéique (N) des lyssavirus. La méthode applique la transcription inversée (RT) en utilisant l’ARN viral comme modèle et oligo (DT)15 et les hexamères aléatoires comme amorces pour synthétiser l’ADN complémentaire viral (CDNA). Ensuite, l’ADNc viral est utilisé comme un modèle pour amplifier un fragment de gène de BP N de 845 dans la PCR de première ronde utilisant des amorces externes, suivi par la PCR imbriquée de deuxième ronde pour amplifier le fragment final de BP de 371 utilisant des amorces internes. Cette méthode peut détecter différents clades génétiques des virus de la rage (RABV). La validation, en utilisant 9 624 échantillons de cerveau de huit espèces animales domestiques dans 10 ans de diagnostics cliniques de rage et de surveillance en Chine, a montré que la méthode a 100% de sensibilité et 99,97% de spécificité par rapport à la fluorescence directe test d’anticorps (FAT), la méthode étalon-or recommandée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE). En outre, la méthode pourrait également amplifier spécifiquement le fragment de gène N ciblé de 15 autres espèces de lyssavirus approuvées et deux nouvelles, dans le 10e rapport du Comité international sur la taxonomie des virus (ICTV), tel qu’évalué par une détection mimique de N plasmides génétiques de tous les lyssavirus. La méthode fournit une alternative pratique au FAT pour le diagnostic de la rage et a été approuvée en tant que norme nationale (GB/T36789) de la Chine.
Introduction
La rage est une maladie zoonotique mondiale causée par des virus dans le genre lyssavirus1. Les lyssavirus (famille Rhabdoviridae) sont des virus à ARN monocaténaires avec un génome d’environ 12 kb qui encode cinq protéines: N, phosphoprotéine (P), protéine matricielle (M), glycoprotéine (G), et la grande protéine ou polymérase (L). À partir des séquences nucléotidiques du gène N, de la distance génétique et des schémas antigéniques, les lyssavirus ont été divisés en 16 espèces, comprenant le virus de la rage classique (RABV) et les virus liés à la rage (RRV): le virus de la chauve-souris de Lagos (LBV), le virus Duvenhage (DUVV ), Mokola virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan virus (ARAV), Ikoma virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV), Irkut virus (IRKV), Khujand virus (KHUV), virus de la chauve-souris du Caucase occidental (WCBV), Shimoni bat virus (SHIBV), et Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Récemment, deux lyssavirus supplémentaires ont été identifiés: kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolé de la chauve-souris de Brandt (Myotis murin) en Finlande en 20173 et Taiwan bat lyssavirus (twblv) isolé d’un Pipistrelle japonais ( Pipistrellus abramus) à Taiwan, Chine en 2016 – 20174.
Tous les mammifères sont sensibles à la rage; Cependant, aucune lésion pathognomonique brute ou aucun signe clinique spécifique ne permet son identification, et le diagnostic ne peut être effectué que dans le laboratoire5. La méthode la plus couramment utilisée pour le diagnostic de la rage est la graisse, qui est considérée comme la norme de l’or par l’OMS et l’OIE5,6. Néanmoins, le FAT peut produire des résultats peu fiables sur des échantillons de tissus cérébraux dégradés/autolysés. En outre, il ne peut pas être utilisé pour le dosage des échantillons de fluides biologiques tels que le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et l’urine, ce qui exclut largement son emploi dans le diagnostic antemortem7. Les tests diagnostiques conventionnels alternatifs, tels que le test d’infection de la culture tissulaire de la rage (RTCIT) et le test d’inoculation de la souris (MIT), nécessitent plusieurs jours6, un inconvénient majeur lorsqu’un diagnostic rapide est essentiel.
Divers tests de diagnostic moléculaire (p. ex., la détection de l’ARN viral par RT-PCR, le test d’immunosorbant PCR – enzyme-linked [PCR-ELISA], l’hybridation in situ et la PCR en temps réel) sont utilisés comme techniques rapides et sensibles pour le diagnostic de la rage8. La RT-PCR est maintenant recommandée par l’OIE pour le diagnostic de routine de la rage, et une PCR heminested (HN) est décrite dans le manuel des tests diagnostiques et des vaccins pour les animaux terrestres de l’OIE pour détecter tous les lyssavirus5. Ici, nous décrivons un pan-lyssavirus imbriqué RT-PCR, qui permet la détection spécifique et sensible de l’ensemble des 18 espèces de lyssavirus comparables ou supérieures à celle obtenue par la graisse. Le principe de la méthode est un RT de l’ARN cible (région conservée du gène du lyssavirus N) dans l’ADNc, suivi de l’amplification de l’ADNc par deux cycles de PCR. L’ADNc subit la PCR de première ronde avec des amorces externes pour amplifier un fragment de BP de 845; Ensuite, la PCR de deuxième cycle utilise le premier produit d’ACP comme modèle pour amplifier un fragment de BP 371 avec des amorces internes. Les deux cycles de PCR augmentent significativement la sensibilité du dosage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actuellement, le RABV est un lyssavirus majeur responsable de la quasi-totalité de la rage humaine et animale en Chine, ainsi que dans d’autres pays. En outre, une variante de l’IRKV a été identifiée pour la première fois à partir d’une chauve-sourisurina leucogaster de Mdans la province de Jilin, dans le nord-est de la Chine, en 2012, et il a été rapporté que la mort d’un chien dans la province du Liaoning était de 201711. Plus récemmen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été appuyée par le plan national de recherche et de développement (Grant no 2016YFD0500401) et la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (Grant No. 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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