İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinin kullanımı Rutgers Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır – Newark Kampüsü. 1. Doku Kültürü Ortamının Hazırlanması ASC’leri izole etmeden önce steril olarak 500 mL doku kültürü ortamı hazırlayın. Kültür ortamını hazırlamak için, Dulbecco’nun yüksek glikoz ve 2 mM L-glutamin içeren minimal esansiyel ortamına (DMEM) tanımlı fetal baldır serumu (FCS) ve Penisilin-Streptomisin (10.000 U/100 mL) ekleyin. Ortam 4 °C’de 3 haftaya kadar saklanabilir ve her zaman sıcak (oda sıcaklığında 37 °C arasında) kullanılmalıdır. Kök hücre kültürü için farklı bir ortam tercih edilirse, bunun yerine bu ortamı hazırlayın. 2. Asc’ların Yağ Dokusundan İzolasyonu Lipoaspirates veya abdominoplasti örnek(ler) elde edin. IRB onayı alındıktan sonra, çeşitli cerrahi işlemlerden sonra doku atmak gibi örnekler alın. Lipoaspirates’ı hangi damarda cerrah doku çıkardısa laboratuvara nakledin; abdominoplasti örneklerini bir ameliyathane numune çantasına veya konteynerde taşıyın. Numuneyi (lar) oda sıcaklığında 6 saate kadar veya 4 °C’de, hemen işlenmezse 24 saate kadar saklayın. Yukarıda belirtilen sürelerin ötesinde işlenen doku örnekleri büyük olasılıkla azalmış bir hücre verime sahip olacaktır. 1x steril fosfat tamponlu tuzlu ilave sina abdominoplasti örnekleri nemli tutun. Bu noktadan itibaren, aseptik koşullar altında bir laminar akış başlık tüm adımları yürütmek. Kişisel koruma için eldiven giyin. Biyolojik dökülmeleri hızlı bir şekilde temizlemek için çamaşır suyu, etanol ve kağıt havluları yakınımda saklayın. Biyomedikal atık olarak herhangi bir fazla doku bertaraf. Numuneleri < 1 mm'lik parçalar halinde doğrama. Abdominoplasti blok çalışmak için çok büyük ise, kıyma önce blok doku yönetilebilir bir boyutu kesti. Abdominoplasti dokusunu steril 100 mm plakanın kapağına aktarın. Yerinde doku bir parça tutmak için steril bir iğne kullanın ve ya kesme veya yavaşça dökme doku parçalama parçaları kıyma için steril bir neşter kullanın. Bu adım genellikle lipoaspirates için gerekli değildir. Ancak, lipoaspirate büyük doku parçaları gözlenirse, steril çalgılar ve yukarıdaki gibi süreç ile bu parçaları kaldırın. Tüm katmanların karıştırılmasını sağlamak için dokuyu yeni bir tüpe aktarın ve numuneyi 5-6 kez ters çevirin veya sallayın. İsteğe bağlı: lipoaspirate tamamen yerleşmiş ise, kaldırma ve karıştırma dan önce yağ tabakası atın. 2,5-5 mL’lik bir dokuyu 100 mm vakum-gaz plazma tedavi doku kültür plakasına(Malzeme Tablosu)aktarın. Taze bir santrifüj tüpüiçine dökerek numunenin hacmini ölçün. Gerekirse, doku transferi ile yardımcı olmak için steril bir spatula kullanın. Plakaya eşdeğer miktarda doku kültürü ortamı ekleyin. Yavaşça içeriğini karıştırmak için plaka girdap. 37 °C’de %5 CO2’de, plakanın tabanında yeterli sayıda hücre bulunana kadar kuluçkaya yat. Zamanla hücreler doku içinden plaka yüzeyine göç eder ve bu noktada plastiğe yapışır. Onlar doku çıkmak gibi, hücreler doku parçaları etrafında küçük kümeler olarak görünür. Her 24 saatte bir, mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın ve medya benzer miktarda değiştirin. Mümkünse doku parçalarını yerinde bırakın. Plakaüzerinde yeterli sayıda hücre (>10 kümeler > 15-25 hücre plaka) veya 7 gün sonra, hangisi daha erken olursa, kalan tüm doku parçalarını çıkarın. Doku kültürü medyasındaki ASC’lerin ‘ine ulaşıncaya kadar veya kümeler yoğun hale gelene kadar (plaka üzerindeki her biri yaklaşık > 500 m çapında olan yoğun hücre kümeleri) bu noktada hücreler geçilecektir. 3 ASC Kültürü Ana plaka yaklaşık % 70 birleşim ulaştığında ASC’leri geçiş. ASC kültürlerin biraraya gelmesinden kaçınmaya özen. Plakayı 1x fosfat tamponlu tuzlu suyla hafifçe durulayın ve yapışık hücreleri deneyin. Hücreleri denemek için, fosfat tamponlu tuzlu aspire ve her plaka ya% 0.25 EDTA ile Trypsin 1 mL ekleyin ve 5 dakika için 37 °C’de kuluçka. 5 dakika sonra, mikroskopi ile de-adherence doğrulayın. Hücreler hala yapışıksa, hücreleri ek 5 dakika için kuvöze geri döndürün. Trypsin’i devre dışı bırakmak için tabağa az miktarda ortam (toplam tripsin hacminin yaklaşık ‘i) ekleyin ve media/trypsin kullanarak plakanın tabanını hafifçe yıkayın. Plakayı yıkamak için, plakayı hafif bir açıyla tutun ve media/tripsin’i plakanın üst kısmından aşağıya doğru hafifçe pipetleyerek, plakadan haftalık bağlı hücreleri gevşetin. Hücreler 1:3 oranında yeniden kaplanabilir veya plaka başına 120.000-500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanabilir. Hücre sayısına göre tohumlama, tipofin/media’yı konik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 300 x g’de 7 dk. Doku Kültürü ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (ilk plaka başına yaklaşık 1 mL) ve tohumlamadan önce hücreleri sayar. Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonunun 10 μL’sini hemositometreye aktarın ve ızgaranın her köşesindeki 4 x 4 çeyreğinde bulunan hücreleri sayın. Hücre numarasını hesaplamak için bu değerleri birlikte ortalaman ve değeri 104 ile çarpın. Hücreleri tohumlamadan önce tabağa ortam ekleyin. Hücreleri damla gibi ekleyin ve sonra plaka boyunca eşit dağılım sağlamak için plaka girdap.NOT: 3 pasajdan sonra yapışık hücreler asimetrik ve iğ şeklinde görünmelidir. ASC fenotip ve davranış akış sitometri ve farklılaşma tahlilleri kullanılarak teyit edilebilir. Akış sitometrisi ve farklılaşma tahlilleri kullanılarak ASC fenotip ve davranışının teyidi Akış sitometrisi Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri toplayın ve pelet. 1x fosfat tamponlu tuzlu ile peletli yıkayın ve üretici antikor önerilen hacimleri ile hücreleri etiket. Akış sitometrisi için ayrıntılı bir protokol, ortak bir laboratuvar prosedürü, burada bulunabilir12,14,15. ASC fenotipini onaylamak için aşağıdakilerden yüzey işaretpanellerini seçin: CD14, CD31, CD34, CD45 ve CD106 için negatif; ve POZITIF CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 ve CD10516,17,18,19. CD36 varlığı ve kemik iliği türetilmiş MSCs 20 CD106 ayırt ASCs yokluğu20. Farklılaşma Tsays: Bir MSC farklılaşma kiti kullanarak çoklu çizgi farklılaşması nı onaylayın. Kitleri adipojenik onaylamak için birden fazla üreticiden mevcuttur, osteojenik, ve kondrojenik farklılaşma kapasitesi. Kit tarafından sağlanan ortamı, üreticinin protokollerine göre 3 hafta boyunca veya morfolojik farklılaşma gözlemlenene kadar her 3-4 günde bir değiştirin. Kültür birden fazla pasajlar için hücreleri; gerekli pasajsayısı uygulamaya bağlıdır. Her pasajda, söz konusu hücre yüzey imanlarını kullanarak MSC hücre morfolojisini ve fenotipini doğrulayın ve çoklu çizgi farklılaştırma kapasitesinin kaybolmadığından emin olun. Genişleme potansiyeli bağışçılar arasında farklılık gösterirken, çoğu örnek 6-9 pasaja kadar genişletilebilir. Hücreleri kriyokorunmuş ve ileride kullanılmak üzere sıvı nitrojen de polar. 4 ASC’lerin Kriyopreservation 10 mL’lik dondurma çözeltisi A ve B hazırlayın. Donma çözeltisi A için, yüksek glikozlu DMEM’e FCS ekleyin. B’nin dondurulması için yüksek glikozlu DMEM’e FCS ve dimetil sülfür (DMSO) ekleyin. 5 dk. Donma çözeltisi A küçük bir hacim de hücreleri resuspend 300 x g santrifüj ederek hücreleri pelet ve adım 3.3.1 olarak bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücrelerin 500.000-1.000.000 hücre/mL’lik son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için yeniden askıya alınacağı son hacmi hesaplayın. Son hacmin ‘sinde peleti yeniden askıya almak için donma solüsyonu A’yı kullanın. Son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için tüpü kışkırtırken yavaş yavaş eşit hacimli donma çözeltisi B damlacık ekleyin. Hemen 1-2 mL cryovials hücreleri dondurmak. Cryovials kontrollü bir hızda dondurucu veya -80 °C’de yerleştirilen dondurucu kabında dondurun, bu da sıcaklığı 1 °C/dk düşürür. Kontrollü donma (bir dondurucu konteyner için bir gecede) sonra, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen hücreleri aktarın.