Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)
Summary
Bu iletişim kuralı bir doğru molar kütle tespiti için protein, protein kompleksleri ve peptidler türdeş olmayan bir örnek yüksek özgüllük iyon değiştirme Kromatografi çok açılı ışık saçılma ile kullanımını açıklar. Bu yöntem kalite değerlendirmesi için de yerli reaksiyonlar, ücret türevleri ve karışık-protein örnekleri karakterizasyonu gelince değerlidir.
Abstract
İyon değiştirme Kromatografi çok açılı ışık saçılma (IEX-MALS) ile protein ayrımı ve karakterizasyonu için güçlü bir yöntemdir. Türdeş olmayan protein örnekleri oligomeric formların veya protein nüfus, karışımları ile bile çok da dahil olmak üzere, karakterizasyonu IEX doğru molar kütle analiz MALS tarafından elde sağlar yüksek özgüllük ayırma tekniği kombinasyonu benzer molar kitleler. Bu nedenle, IEX-MALS protein karakterizasyonu ek bir düzeyi sağlar ve çok açılı ışık saçılma (sn-MALS) tekniği ile standart boyut-dışlama Kromatografi için tamamlayıcı olur.
Burada bir temel IEX MALS deneme ve sığır serum albumin (BSA) bu yöntemi göstermek için bir protokol açıklayın. IEX molar kütle analiz MALS her bireysel form tarafından izin oligomeric formları için BSA ayıran. IEX-MALS deney duruma getirilmesi de sunulan ve BSA, BSA monomerler ve daha büyük reaksiyonlar arasında mükemmel ayrılık elde üzerinde gösterdi. İyi ayırma ve molar kütle belirlenmesi bir örnek var birden fazla protein türlerin sağladığı IEX-MALS protein kalite değerlendirmesi için değerli bir tekniktir.
Introduction
Nicel protein ürünleri kalite kontrol (QC), aracı olarak giderek temel karakterizasyonudur biyofarmasotik sanayi ve güvenilirlik ve hayat bilgisi bütünlüğünü garanti altına almak için yasal amaçlar için her ikisi de1 araştırma , 2. protein Web sitelerinde açıklandığı gibi Avrupa’nın biyofiziksel araştırma ve moleküler biyofizik (ARBRE-MOBIEU) Avrupa’da Protein üretimi ve arıtma ortaklık Avrupa (P4EU) ve kaynakları Derneği iletişim (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs ve https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, sırasıyla), protein QC sadece nihai ürün, ama aynı zamanda oligomeric durumuna, Homojenizasyon, kimlik, saflık karakterize gerekir biçimi, yapısı, ardından değişiklikleri ve diğer özellikleri3,4.
SN-MALS en yaygın QC karakterizasyonu yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde, analitik bir sn sütun MALS ve spektrofotometrik ve refractometric dedektörleri, her tepe5protein molar kütlesi doğru ölçümler etkinleştirme için birleştirilmiştir. SN-MALS elüsyon birimin bağımsız olarak eluted doruklarına molar kütle belirler ve sütun ayarı’nı kullanarak analitik sn yanlışlık üstesinden gelir. Dinamik bir ışık saçılım (DL) modül ilavesi hidrodinamik RADIUS belirlenmesi sağlayan boyutu ölçüm yeteneği ekler. Akademik araştırma, sn-MALS genellikle bir protein, onun uyum, saflık, toplama ve modifiye proteinleri glikoproteinlerin veya lipid çözündürüldükten membran proteinlerinin gibi düzey düzeyini oligomeric durumunu belirlemek için kullanılır (belirlemek protein molar kütle ve bileşenleri tek tek eşlenik)6,7,8.
Birçok durumda, bir arıtma sürecinin son protein iyi tanımlanmış moleküler türler değildir ama oldukça bazı heterojenite oluşmaktadır. Böyle bir karışımı protein yapısı (örneğin, farklı oligomeric formlar), biçimler veya protein izoformlarının açısından farklı olabilir. Protein heterojenite Ayrıca C-terminal lizin işleme veya asparagine/glutamin Deaminasyon, varyasyon9,10şarj etmek için önde gelen neden küçük kimyasal farklılıkları bir sonucu olabilir. Glikozilasyon gibi ardından değişiklikleri farklılıkları da şarj varyasyonları9türdeş olmayan örnekleri yol açabilir. Heterojenite farklı bu tür protein biyofiziksel özellikleri yansıtılır ve istikrar ve biyolojik Etkinlik hedef protein11etkileyebilir.
Güvenilir kalite kontrol deneyleri türdeş olmayan bu tür örneklerin çok resolutive analitik ayırma tekniği gerektirir. Nerede iyi ayrılık nedeniyle kusurlu sn-MALS analizine yol onların sınırlı çözünürlük ve renk ayrımı yetenekleri12, analitik sn sütunlarla ulaşmak için meydan okunabilir durumlar vardır. Bir yüksek-özgüllük ayırma tekniği gibi IEX MALS ile birleştirerek sn-MALS sınırlamayı heterojen örneklerinde aşmak ve protein karakterizasyonu (tablo 1 Amartely vd.12‘) için tamamlayıcı bir yöntem sağlayın. Oluştururlar onların hidrodinamik boyutu13tarafından ayıran, sn IEX onların yüzey ücret14tarafından oluştururlar ayırır. Anyon exchange (AIEX) ve katyon değişim (CIEX) matrisleri bağlama çeşitleri, sırasıyla olumsuz ve olumlu ücret. Bir nispeten yakın kitle veya şekil paylaşmak protein nüfus arasında iyi bir ayrım ile IEX-MALS başarıyla bireysel protein eyaletlerinde bir karışımı örnek12molar kütlesi belirler.
Burada bir IEX-MALS deney ayırma ve çözümleme var BSA oligomeric formları aynı örnek çalıştırmak için standart bir protokol mevcut. Bir IEX sütun belirli bir protein için önemli ve çok tartışılan, seçimdir arabellekleri pH ve iletkenlik koşullarının yanı sıra. IEX-MALS deneysel verilerin analizi de Adım adım açıklanmıştır. BSA reaksiyonlar ayrılması iyi ve sn-MALS yeterli olsa da, BSA IEX-MALS yetenekleri göstermek için ve bir deney optimizasyonu göstermek için iyi bir örnek olduğunu. Zavallı ayrılık elde sn-MALS ve uygun ayırma ve IEX-MALS tarafından etkin analiz örnekleri bir önceki çalışmada12içinde ele alınmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
IEX-MALS yerli reaksiyonlar, özgün olmayan toplamları, kovalent ve kovalent karakterize protein ayrımı ve saf protein de aynı derecede-in türdeş olmayan örnekleri, doğru molar kütle tayini sağlar karakterizasyonu için güçlü bir yöntem olduğunu kompleksleri ve conjugated proteinler. Doğrusal gradyan veya tuz konsantrasyonu adımlar bir dizi oluşan bir program iyi bir ayrılık protein örneğin alınma olasılığını elde etmek ve her bireysel Peak MALS tarafından uygun analiz izin verebilirsiniz. Daha fazla en iyi duruma getirme degrade gibi farklı parametreleri değişen tarafından (bkz. Adım 3.4 Protokolü) eğimlidir, daha iyi bir çözünürlük gerekliyse yapılabilir. Protein karakterizasyonu, sn-MALS gibi diğer yöntemler için tamamlayıcı bir ek, kritik düzeyi sağlar beri IEX-MALS değerli protein kalite kontrol tahlil olabilir.
SN-MALS protein molar kütle tayini için standart ve ortak teknik olmakla birlikte, standart analitik sn sütun nispeten düşük çözünürlük doğru molar kütle ölçüleri MALS12tarafından elde sınırlayabilir. Ardışık reaksiyonlar, toplama tam monomer tepe ve türdeş olmayan nüfus değiştirilmiş proteinler gibi benzer molar kitleler ile ayrılmış değil yüksek düzeyde içeren çözümler sn-MALS sınırlamaları bazı örnekler.
IEX tasarım ve sn yürütmek için daha karmaşık bir Kromatografi yöntemi, ama bir IEX-MALS deneyden elde edilen bilgileri tamamlamak ve bazen sn-MALS analiz daha daha da bilgilendirici. IEX-MALS başarıyla sn ve analiz etmek zor olan kısa peptidler sn12,24tarafından ayrılmış değil tamamen aynı molar kütle, reaksiyonlar paylaşmak antikor türevleri karakterize. Ayrıca, SEC tarafından tam (içeren viral DNA) ve boş adeno ilişkili virüs (AAV), parçacıkların gibi ayrılması için fazla büyüktür makromoleküllerin derlemeler IEX25 MALS analiz önce tarafından çözülebilir. SN için karşılaştırıldığında, IEX daha farklı renk ayrımı yetenekleri14 sağlar ve tampon pH, tuz, türleri ve uzunluğunu sütun ve diğerleri gibi en yüksek çözünürlüğünü artırmak için çeşitli parametreler ayarlama esnekliğe sahiptir. SN, IEX örnek enjeksiyon için hiçbir ses kısıtlaması yoktur ve herhangi bir molekül boyutuna bağımsız analiz edilebilir (bkz. Tablo 1 Amartely vd.12). Bu örnekleri çok küçük proteinler veya toplama toplama üzerine için bir eğilim ile seyreltilmiş proteinler gibi düşük bir LS yoğunluğu ile başta olmak üzere IEX-MALS, büyük bir avantajı var. Analitik IEX sütun daha istikrarlı ve daha az parçacıklar sn sütunları daha serbest bırakmak eğilimindedir beri IEX-MALS çok kısa denge zaman gerektirir ve LS sinyalleri çok hızlı stabilize. Bu bireysel deneyler bu protokolü açıklandığı gibi çalışan ve gerekli olarak çalıştır durdurma sağlar.
SN, genellikle sağlayan iyi sonuçlar bir tek (bir sütun ile doğru ayırma aralığı kullanarak) deneme, IEX yöntem parametreleri ayarlama tarafından en iyi çözünürlük elde etmek için çeşitli deneyler gerektirebilir. IEX-MALS deneylerde bu tuz degradeyle arabellek iletkenlik gerçekleştirilir ve bu nedenle, RI önemli ölçüde değiştirmek çalışma sırasında RI sinyal sonucu yapılan değişikliklerle. Bunun için ek bir boş konsantrasyon analizi (nesli bir temanın bilgi gerektiren UV algılama için sınırlı olmadığı sürece (protokol 5.2. adımında açıklandığı gibi) temel çıkarma ile her IEX-MALS deney ve bir analiz için çalıştırmak gerekir her tepe için katsayıları). Temel çıkarma ile analiz doğrusal gradyanlar için sağlam olmasına rağmen daha fazla geliştirme yöntemi tuz kademeli programları başarılı temel çıkarma için gerekli bir parametredir. Her tepe dn/dc değerleri belirli bir arabellek iletkenlik (hesaplamalar edebiyat12‘ bulunabilir) eluted zirvesinde göre ayarlanmalıdır. Eğer bu ayarı 200 mM (BSA örnekte benzeri), düşük bir NaCl konsantrasyon adlı bir protein eluted ihmal edilebilir düzeydedir.
SN-MALS için karşılaştırıldığında IEX-MALS (ayrıntılı olarak açıklandığı adım 2.3 iletişim kuralı) olarak kullanılan protein göreceli olarak büyük miktarda tuz degrade ve kusurlu karıştırılması nedeniyle RI dalgalanmalar nedeniyle RI sinyal dramatik değişim üstesinden gelmek önemlidir Degrade arabellekleri. UV algılama kitle ölçüm için kullanılan yalnızca, küçük miktarlarda kullanılır. Protein enjekte miktar protein, Homojenizasyon, saflık ve UV yok olma katsayısı molar kütlesi üzerinde bağlıdır. Gerekli enjekte kitle daha küçük proteinler için daha yüksek ve daha büyük proteinler (~ 1 mg 20 kDa protein ve ~0.2 mg 150 kDa protein için) daha düşük olmalıdır. Miktarı arasında birkaç nüfus ayrılmıştır beri türdeş olmayan örnekleri daha fazla örnek enjeksiyon gerektirir. Analitik yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) bir FPLC sistemi daha az malzeme gerektirebilir.
Son zamanlarda, satır içi analiz MALS arıtma işlemleri sırasında bildirilmiştir. Gerçek zamanlı bir analiz arıtma sırasında oluşur ve herhangi bir daha fazla çözümleme protein ihtiyacını arıtma26sonra ortadan kaldırabilir toplama ürünleri algılamak için çok etkilidir. IEX Kromatografi sık bir ara arıtma adım olarak kullanılır; Böylece, MALS ile partiye hazırlık IEX sütun birleşimi sadece bir analitik karakterizasyon yöntemi aynı zamanda büyük ölçekli arıtma işlemlerinin gerçek zamanlı bir analiz olarak yararlı olabilir. Nonanalytical IEX sütunları da istikrarlı, parçacık bırakmadan düşük bir derece ile ve bu nedenle, MALS ile kullanılabilir. Benzeşme Kromatografi veya hidrofobik Satım Kromatografi, gibi diğer ayırma teknikleri (MALS ve RI dedektörleri kirlenmesini önlemek için) ne zaman nispeten saf örnekleri için tabi MALS ile kombine edilebilir. Bu adaptasyon gerektirir ve sadece iyi en yüksek ayırma ama aynı zamanda yeterince temiz LS ve RI elde etmek için yöntem duruma getirilmesi için başarılı bir MALS analiz sinyalleri.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Tsafi Danieli (Yapısal Biyoloji, İbrani Üniversitesi uygulanan Wolfson Merkezi) onun tavsiye ve işbirlikleri için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Danyel biyoteknoloji Ltd. (Rehovot, İsrail) Bu çalışmada kullanılan analitik FPLC-MALS sisteminin kurulması ve yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
| 0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
| BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
| miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
| mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
| Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
| 0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
| Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
| TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |
References
- Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
- Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
- Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
- Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
- Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
- Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
- Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
- Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
- Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
- Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -. L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
- Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
- Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
- Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
- Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
- Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
- Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
- Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
- Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
- Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
- Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).
