Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика
Summary
Этот протокол описывает использование высокой специфичности ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света для точного определения молярной массы белков, белковых комплексов и пептидов в гетерогенной пробе. Этот метод является ценным для оценки качества, а также как характеристика родной олигомеров, заряд вариантов и образцы смешанные протеина.
Abstract
Ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света (IEX-МЭЛС) является мощный метод для разделения белков и характеристика. Сочетание высокой специфика разделения методики, которую IEX с точной молярной массы анализа, достигается MALS позволяет характеристика гетерогенных белков образцов, включая смеси олигомерных форм или белка населения, даже с очень Подобные молярной массы. Таким образом IEX-МЭЛС обеспечивает дополнительный уровень белка характеристика и дополняет стандартный размер-гель-проникающей хроматографии с мульти-угол рассеяния света (SEC-МЭЛС) техники.
Здесь мы описываем протокол для основных IEX-МЭЛС экспериментировать и продемонстрировать этот метод на бычьим сывороточным альбумином (БСА). IEX отделяет BSA его олигомерных форм, позволяя молярной массы анализ MALS каждой формы. Оптимизации эксперимента IEX-МЭЛС также представил и продемонстрировал на ЗБТ, достижения отличное разделение между BSA мономеров и больших олигомеров. IEX-МЭЛС является полезен для оценки качества белка, так как он обеспечивает тонкой сепарации и молярной массы определение нескольких видов белков, которые существуют в образце.
Introduction
Количественная характеристика белковых продуктов все более важное значение как средство контроля качества (КК), и для целей регулирования в биофармацевтической промышленности и гарантировать надежность и целостность жизни науки исследования1 , 2. как описано на веб-сайтах белка сетей производства белка и очистки партнерство в Европе (P4EU) и объединения ресурсов для биофизических исследований в Европе и молекулярной биофизики в Европе (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs и https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, соответственно), белок КК должны характеризоваться не только чистота конечного продукта, но также его олигомерных государства, однородность, личность, конформации, структура, Посттрансляционная изменения и другие свойства3,4.
Одним из наиболее распространенных методов КК характеристика — SEC-МЭЛС. В этом методе столбец аналитической SEC сочетается МЭЛС и спектрофотометрические и рефрактометрический детекторы, включение точных измерений молярной массы белка каждого пика5. SEC-МЭЛС определяет Молярная масса eluted пиков независимо от громкости элюции и преодолевает неточность аналитических сек, с помощью столбца калибровки. Добавление динамического рассеяния света (DLS) модуля добавляет возможность измерения размера, позволяя определение гидродинамических радиус. В научных исследованиях, SEC-МЭЛС обычно используется для определения состояния олигомерных белок, ее конформации, уровень чистоты, уровень агрегирования и изменение белков, таких как гликопротеины или липидов солюбилизирован мембранных белков (определить Молярная масса белка и сопряженные компоненты отдельно)6,,78.
Во многих случаях окончательный белок процесс очистки не является хорошо ворит молекулярных видов, но скорее включает некоторые неоднородности. Белков в такой смеси могут быть разнообразны с точки зрения структуры (например, различные олигомерных формы), конформации или изоформ белка. Гетерогенность белка также может быть результатом незначительных химических различий, вызванных C-терминала лизин обработки или аспарагин/глютамина дезаминирование, ведущих к взимать вариация9,10. Различия в Посттрансляционная модификации, такие как гликозилирования может также привести к гетерогенных образцы с заряд вариации9. Эти различные типы гетерогенности отражаются в биофизические характеристики белков и может повлиять на стабильность и биологическая активность целевого белка11.
Надежный контроль качества анализов образцов таких разнородных требуют весьма резолютивной аналитическое разделение техника. Бывают случаи, когда хорошее разделение может быть оспорено достичь с Аналитические колонки SEC, ввиду их ограниченной резолюции и разделения способности12, привело недостатки SEC-МЭЛС анализа. Сочетание высокой специфика разделения техника например IEX с MALS может преодолеть ограничение SEC-МЭЛС в гетерогенных образцов и обеспечивают дополнительный метод для белка характеристика (таблица 1 в Amartely et al.12). В отличие от SEC, который отделяет макромолекул, их гидродинамические размер13, IEX отделяет макромолекул, их поверхности бесплатно14. Анион обмен (AIEX) и катионного обмена (CIEX) матриц bind негативно и позитивно взимается варианты, соответственно. С тонкой разделения между населением белков, которые имеют относительно близко массы или форму IEX-МЭЛС успешно определяет Молярная масса каждого государства индивидуальных белков в смеси образца12.
Здесь мы представляем стандартный протокол для запуска эксперимента IEX-МЭЛС для разделения и анализа BSA олигомерных форм, которые существуют в той же пробы. Выбор IEX колонку для определенного белка является важным и обсуждены, а также pH и проводимости условия буферов. Анализ экспериментальных данных IEX-МЭЛС также описаны шаг за шагом. Хотя разделение BSA олигомеров, хороший и достаточно в SEC-МЭЛС, BSA является хорошим примером показать возможности IEX-МЭЛС и продемонстрировать оптимизацию эксперимента. В предыдущем исследовании12рассматриваются примеры достигнутых SEC-МЭЛС и надлежащего разделения и анализа, активизируемые IEX-МЭЛС бедных разделения.
Protocol
Representative Results
Discussion
IEX-МЭЛС-это мощный метод для разделения белков и характеристика, которая позволяет точное молярной массы определение чистого белков, а также гетерогенных образцы, характеризующие родной олигомеров, неродном агрегатов, ковалентных и нековалентных комплексы и сложные белки. Программа, состоящая из линейного градиента или серию шагов, концентрация соли может обеспечить хорошее разделение белков населения и позволяют надлежащего анализа каждого индивидуального пика МЭЛС. Дальнейшая оптимизация путем изменения различных параметров, таких как градиент склона (см. шаг 3.4 протокола), может быть выполнена, если лучшее разрешение не требуется. IEX-МЭЛС может быть пробирного контроля качества полноценного белка, так как он обеспечивает дополнительные, критический уровень характеристика белков, дополняет другие методы, такие как SEC-МЭЛС.
Хотя SEC-МЭЛС стандартные и традиционные техники для молярной массы определения белка, относительно низкое разрешение стандартного аналитического SEC столбцов может ограничить Точная Молярная измерений массы, достигнутый MALS12. Некоторые примеры ограничений SEC-МЭЛС решения, которые содержат последовательных олигомеров, высокий уровень агрегирования, которые полностью не отделены от мономера пик и разнородных популяций с аналогичные молярной массы, такие как изменение белки.
IEX-это более сложный метод хроматографии для проектирования и выполнения чем сек, однако информация, полученная из эксперимента IEX-МЭЛС может дополнять и иногда быть еще более информативным, чем анализ SEC-МЭЛС. IEX-МЭЛС успешно характеризуется варианты антитела, которые разделяют же молярной массы, олигомеры, которые не разделяются полностью на SEC и короткие пептиды, которые трудно анализировать SEC12,24. Кроме того макромолекулярных сборки, которые слишком велики, чтобы быть разделены SEC, таких как полный (содержащий вирусной ДНК) и пустой частицы аденоассоциированный вирус (AAV), может быть решена IEX25 до MALS анализа. По сравнению с SEC, IEX предлагает более разнообразные возможности разделения14 , и она имеет гибкость корректировки нескольких параметров, чтобы увеличить разрешение пик, например буфер рН, типы соли, типы и длины столбца, и др. В отличие от SEC, существует ограничение громкости для образца инъекций в IEX, и любой молекулы могут быть проанализированы независимо от его размера (см. таблицу 1 в Amartely et al.12). Это большое преимущество IEX-МЭЛС, главным образом для образцов с низкой интенсивностью LS, например очень маленькие белки или разбавленных белки с тенденцией для агрегирования по концентрации. Так как аналитические колонки IEX являются более стабильными и выпустить меньше частиц, чем SEC колонны, как правило, IEX-МЭЛС требует уравновешивания очень короткое время, и LS сигналы стабилизируются очень быстро. Это позволяет запуск отдельных экспериментов, как описано в настоящем Протоколе и остановка выполнения при необходимости.
В отличие от SEC, которая обычно обеспечивает прекрасные результаты с только один эксперимент (с помощью столбца с правой фракционирование диапазон), IEX может потребовать несколько экспериментов для достижения оптимального разрешения путем настройки параметров метода. В экспериментах IEX-МЭЛС выполняются с градиентом соли, буфер проводимость и, следовательно, Ри резко изменить во время выполнения, с последующими изменениями на ри сигнал. Это требует дополнительное пустое, запускать для каждого IEX-МЭЛС эксперимента и анализ с вычитание (как описано в шаге 5.2 протокола), если анализ концентрации ограничивается УФ обнаружения (требует априорного знания вымирания коэффициенты для каждого пика). Анализ с вычитание надежными для линейных градиентов, несмотря на то, что дальнейшее развитие метода все еще требуется для успешного вычитание соли ступенчатой программ. Dn/dc значения каждого пика должны корректироваться согласно конкретных буфера проводимости на eluted пик (вычисления можно найти в литературе12). Если белок этого eluted при концентрации NaCl, ниже, чем 200 мм (как в примере BSA), эта корректировка является незначительным.
Относительно большое количество белка, используемых в IEX-МЭЛС (как описано в шаге 2.3 протокола), по сравнению с SEC-МЭЛС важно преодолеть драматические изменения сигнала ри, вызванные соль градиента и Ри колебания из-за несовершенной смешивания градиент буферов. Если УФ обнаружения используется для измерения массы, только меньшие суммы может быть использован. Количество белка для вставки зависит от Молярная масса белка, однородности, чистоты и коэффициент вымирания УФ. Необходимости вводят масса должна быть выше для более малые протеины и ниже для более крупных белков (~ 1 мг за 20 кДа белками и ~0.2 мг для 150 kDa белок). Гетерогенных образцы требуют введения более образца, так как количество делится между несколькими населения. Аналитические высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может потребоваться меньше материала, чем система ПСОК.
Недавно было сообщено в линии анализ с использованием MALS во время процедуры очистки. Такой анализ в реальном времени является очень эффективным для обнаружения статистической продукции, которые возникают во время очистки и может устранить необходимость для любого дальнейшего анализа белка после очистки26. IEX хроматографии часто используется в качестве промежуточного очистки шага; Таким образом сочетание препаративные IEX столбцов с MALS может быть полезным не только как метод аналитических характеристик, но и как в реальном времени анализ крупномасштабных очистительных процедур. Nonanalytical IEX столбцы также являются стабильными, с низкой степенью выпускать частиц и, таким образом, может быть использован с МЭЛС. Другие методы разделения, например аффинной хроматографии или гидрофобные обмен хроматографии, могут также сочетаться с MALS подвергано к относительно чистой пробы (чтобы избежать загрязнения МЭЛС и Ри детекторов). Это потребует адаптации и оптимизации метода для получения не только хороший пик разделения, но также достаточно чистой LS и Ри сигналы для успешного анализа МЭЛС.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктор Tsafi Danieli (Wolfson центр применяется структурной биологии, Еврейский университет) за ее советы и сотрудничество. Авторы также поблагодарить Danyel Biotech Ltd. (Реховот, Израиль) за помощь и создание аналитической системы ПСОК-МЭЛС, используемые в данном исследовании.
Materials
| ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
| 0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
| BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
| miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
| mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
| Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
| 0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
| Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
| TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |
References
- Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
- Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
- Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
- Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
- Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
- Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
- Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
- Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
- Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
- Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -. L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
- Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
- Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
- Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
- Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
- Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
- Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
- Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
- Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
- Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
- Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).
