イオン交換クロマトグラフィー (IEX) 蛋白質の分離とキャラクタリゼーションの多角度光散乱 (MALS) に結合

1. システムの準備 制御、データ集録、およびメーカーの分析のため、各ソフトウェア パッケージと共にタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムと MALS/屈折のインデックス (RI) 検出器 (材料の表を参照) をインストールします。指示に従います。 MALS と RI 検出器下流 FPLC の UV と電気伝導度検出器を接続します。紫外線と MALS 検出器間 interdetector の容積を最小限に抑えるための pH 勾配のため絶対に必要がある場合は、pH 検出器をバイパスします。0.25-0.5 のキャピラリー チューブを使用して、列と検出器廃棄物や一部のコレクターに RI 検出器の出力の 0.75 mm 内径キャピラリー チューブの径 (内径) mm。 MALS Aux 入力に FPLC 検出器から UV アナログ出力、MALS Autoinject に、I/O ボックスを介して、FPLC からデジタル出力を含む FPLC と検出器の間に必要な信号接続が確立されていることを確認します。 2. サンプルとバッファーの準備 0.1 μ m のフィルターで洗浄と溶出バッファーを含むすべての試薬をフィルター処理します。廃瓶の中に乾燥フィルターから微粒子を除去するために最初の 50-100 mL のバッファーをフィルター、ろ過された水で徹底的に洗浄されており、入力からほこりを防ぐためにおおわれて清潔で滅菌ボトルでバッファーの残りの部分を保ちます。 BSA サンプルの pH とイオン強度を調整する (例えば、pH = 8、50 mM NaCl) 希釈、限外ろ過、またはバッファー交換の手順中に IEX 列へのバインドを許可します。注: 目的の素材は削除されません最小孔径に蛋白質のサンプルをプレフィルターにお勧め (0.02-0.1 μ m)。また、サンプルは、大粒子の沈殿物を有効にする 10 分間高速 (13,000-16,000 x g) で遠心できます。 少なくとも 0.3 – 0.5 を準備 BSA の mg (材料の表を参照) 良質 MALS 分析を達成するため 1 mL 列 (5/50 mm) で注入します。注入量、限定されないことに注意してください。 3. 選択とタンパク質 IEX 法の開発 ExPASy にProtparam ツールなどのサーバーの場合は、ウェブサイトに使用される15をすることができます、一次配列に基づくタンパク質の等電点 (pI) を計算します。BSA の pI が 5.8 であることに注意してください。 列のタイプとバッファーのパラメーターを選択します。 PK、バッファーのと、バッファーのイオンの性質によって AIEX と CIEX、別のバッファーを使用します。小さなポリマーと CIEX 列の実行時 AIEX 列とアニオン性バッファーを実行するときは、カチオン性のバッファーを使用します。この例では、AIEX 列の BSA の解析のための pH 8、20 mM トリス塩酸バッファーを使用します。 Pi が 7、BSA などより低い蛋白質のための少なくとも 2 つのユニットによる pI より高い pH AIEX 列とバッファーを使用します。Pi が 7 より高い蛋白質のための少なくとも 2 つのユニットによる蛋白質の pI より低い pH CIEX 列とバッファーを使用します。 タンパク質と列のマトリックスの結合の強さに応じてバッファー pH を最適化します。タンパク質は列にはバインドされない場合、は、pI の遠くから pH を使用します。タンパク質は使用 pH で安定していることを確認します。 バインドで低塩分濃度を使用し、蛋白質の結合は、ロードされたサンプルのイオン強度に依存するため, 行列に蛋白質の結合を許可するバッファーを洗ってください。蛋白質は通常彼らの安定性のいくつかの塩を必要とします。したがって、タンパク質の読み込みと列洗濯の手順中に 50 mM NaCl (または代替塩) を使用します。 溶出バッファー列からの蛋白質をデタッチするのには 0.5 M の NaCl の最大値を使用します。注: 器械の範囲の制限により標準モデル RI 糖度計を使用する場合より高い塩濃度は推奨されません。しかし、高濃度モデルは使用することができます、2 M の NaCl を収容します。 最初のメソッドを次のように実行します。 BSA の 1 mg を読み込む (6 mg/mL の 170 μ L) pH 8、20 mM トリス塩酸バッファーの読み込みバッファーの ~0.5 ml 50 mM NaCl を含みます。光散乱 (LS)、UV、まで非連結分子および粒子システムからの完全な溶出を許可する 10-15 列ボリューム (CV) に同じバッファーを洗い流すし、RI 信号が完全に安定化します。 20-30 CV、20 mM トリス-HCl、pH 8 の溶出バッファーを使用して、列からの蛋白質をデタッチするのには 0.5 M の NaCl を含むの短い、線形塩グラデーションを実行します。溶出バッファーの 0-100% (または代替の広範なグラデーション) のグラデーションを実行または 2 つのグラデーションに分割: 溶出バッファーの 0-50% の追加勾配溶出バッファー、各グラデーション 10-20 CV のための 50%-100% の順。BSA の 30 の広範な勾配 15%-70% を使用して、最初のメソッドの CV。注: いくつかのインスタンスで最初のメソッドがあります信頼性の高い MALS 分析のための分離、追加は必要ありません。多くのケースでは、初期のメソッドは、メソッド最適化を行うためのガイダンスだけを提供します。 解像度を上げるし、さまざまなパラメーターを変更することによってピークの分離を改善する IEX メソッドを最適化します。 グラデーションの傾斜と長さを変更します。穏やかな斜面で長い勾配を提供よりよい分離の低いピーク高斜面ショート グラデーションと少ない分離強烈なピークを提供します。最適な MALS 分析ピーク解像度と信号強度の間のバランスを見つけます。注意: LS、UV を増やすことができます蛋白質のより高い量の読み込みと RI 信号は、解像度を犠牲にして 。 溶出は、段階的な塩分濃度プロファイルを使用します。手順と線形グラデーションの組み合わせを用いを覚えています。 ピークの分離を改善するために流量を減少させます。注: 非常に小さな粒子とマトリックスのためこれは非常に重要です。 サンプルのタンパク質集団間でバリエーションを増やすし、それらの変形の間の分離を強化するためにバッファー pH を変更します。メモ異なる pH で正しく 1 つの pH で分離されていない蛋白質を分けることができます。 IEX 列からの蛋白質をデタッチするのに勾配、線形、段階的、pH を使用します。PH や塩濃度の変動に応じて組み合わせる溶出グラデーションを使用します。 MgCl2、または酢酸ナトリウムなどの弱い塩などの強い塩を使用して、感度と分解能16を増やします。 小さい粒子の分離能力を向上させる長い IEX 列または異なる列マトリックスを使用します。 (AIEX/CIEX) 分離の別パターンを提供する列の型を変更します。強い、弱い、または結合された (混在モード) の配位子と行列もあり、いくつかのサンプルの解像度を向上させることができることに注意してください。 別のマトリックス樹脂に接続されている同じ配位子を持つ別のサプライヤーからの列を使用します。リガンドは、独立ガレージ自体は異なる蛋白質と相互に作用でき、分離特性に影響を与えます。 タンパク質の安定性を改善し、IEX 実験を改善するために蛋白質の集合を防ぐバッファー、添加物 (溶液中のタンパク質の安定化分子) があります。注: このような添加物の例としては、糖アルコール、尿素、非イオン性、両性イオン洗剤、塩17,18カオトロ ピックと kosmotropic。 4. IEX MALS 実験 MALS ソフトウェアのメソッドから New\Experiment を開き、光散乱法システムフォルダーからオンラインの方法を選択します。DLS モジュールが DLS データが取得する場合は、光 Scattering\With QELSサブフォルダーからオンラインのメソッドを選択します。 構成セクションの下の実行のパラメーターを設定します。 FPLC (1.5 mL/分) で使用される流量汎用ポンプセクションで実行の流量を設定し、入力または溶媒] セクションの [バッファー パラメーターを確認します。 タンパク質名 (BSA)、屈折率増分を入力 (dn/dc; 標準タンパク質の値は 0.185 mL/g)、280 の波長に紫外線吸光係数の蛋白質のサンプル (6 mg/mL) の濃度と nm (0.66 g/L-1·cm-1)、インジェクター ] セクションの [サンプル] タブの。インジェクション (170 μ L) 同じセクションの下で同様のサンプル ボリュームを挿入します。 基本的なコレクション] タブの [手順] セクションでAutoinject のトリガーチェック ボックスをオンし、グラデーションが達した後、少なくとも 5 分間継続するデータ コレクションの実行期間を設定、最終的な値。 FPLC ソフトウェアでテストのパラメーターを設定します。 [メソッド エディター ] タブで新しいテストを作成します。最初の実験は、塩や pH の線形グラデーションになります (手順 3.3 参照)。最適化されたメソッドの最初のメソッド中により特定のグラデーションまたは溶出結果に応じて段階的なプログラムを作成 (手順 3.4 と図 1を参照)。MALS ソフトウェアでのデータ収集をトリガーするメソッドにパルス信号を含めます。 列と関連するバッファーを持つバルブを洗う: 20 mM トリス-HCl、pH 8、50 mM NaCl 洗浄バッファー (弁) および溶出バッファー (B バルブ) の 500 mM の NaCl と同じバッファーの。最後のカラム洗浄が列行列に蛋白質の結合を有効にする低塩分濃度を含む結合バッファーを使用することを確認します。厳密にバインドされた不純物の大規模な洗浄、中和バッファー洗浄に続いて、関連するバッファーを洗浄する前に 0.5 M NaOH を使用します。 注射器を使用してループに蛋白質のサンプルを置きます。10 mL 以上のサンプルをロードすると、フィルターのポンプおよび FPLC のミキサーをバイパスしながら、superloop または FPLC 楽器のポンプ バルブを使用します。 FPLC ソフトウェアを実行] ボタンをクリックしをクリックして、MALS ソフトウェアの最初実験を開始します。MALS 検出器を経由して FPLC 楽器からパルス信号を受信した後データが収集されます。 実行と IEX MALS がスタンドアロンのメソッドの代わりに連続的な流れモードで手動で実行された場合、手順 4.1-4.4 で説明の同じパラメーターを適用します。 Final メソッドを確認して実行して、空白の挿入 (サンプルではなく読み込みバッファー) を使用して同じ方法正確を実行します。Autoinject パルスと空白の実行のグラデーションのタイミング、実行サンプルを同一であることが重要です。 5. IEX MALS 実験データの分析 MALS ソフトウェアで解析手順」セクション手順を実行します。基本的なコレクションビューには、実験の生データ コレクションが表示されます。 彼らは多くのノイズを示す場合のクロマト グラムを滑らかにするのに [ Despiking ] タブを使用します。通常、正常なレベルを使用します。 すべての信号のベースラインを定義 (LS、UV、RI 検出器)ベースラインビューで。 ピークビューの分析のためのピークを定義します。Dn/dc と各ピークの下の蛋白質のための UV 吸光係数の正確な値を確認します。注意: 蛋白質のためそれは 0.185 mL/g の標準 RI インクリメント値を使用する一般的なが他の高分子の分子の性質によると異なる dn/dc 値を使用する必要があります。ショ糖などの糖類が 0.145 mL/g20 dn/dc 平均値と脂質と洗剤の範囲 0.1-0.16 の間の dn/dc 値、ポリヌクレオチド (DNA ・ RNA) の平均 dn/dc は 0.17 mL/g19mL/g21。 モル質量と半径の継ぎ手パラメーターとモル質量と LS から半径、 Rh QELS からビューの相関関数を使用して分析します。 塩濃度の増加に伴い IEX MALS の間に大きな RI 信号の変更を実行します。したがって、RI データを必要とする大量の計算に空白の注入からの基準信号を減算します。 タンパク質と空白 IEX MALS 実験の両方を開きます。蛋白質テスト名を右クリックし、 Apply メソッドを選択し、ファイル ダイアログ ボックスから基線の減算フォルダーを選択します。標準的なモル質量分析法 (例えば、オンライン) の適切な型を選択します。新しい開いているメソッドのパラメーターとタンパク質の実験用に定義された設定が保存されることに注意してください。 基線の減算表示インポート空白空白の実行の信号をインポートするをクリックします。楽器(インポート空白のボタン) の横にある、[減算する検出器のすべてをチェックします。 ピークビューでソリューションの RI が実行12時に変更されたのでタンパク質のピーク面積で溶液の伝導率による dn/dc 値 (必要な場合) を調整します。 BSA モノマー IEX MALS システムを校正します。注: 通常、IEX MALS システムは、定期的に校正されてピーク配置、バンドの広がり、および正規化の旋回 (Rg) の半径を持つ単分散タンパク質を用いた 90 ° 検出器の角度検出器の < 10 nm、BSA モノマーなど。この例では、BSA は校正分子としての両方を提供しています、自体モル質量分析の対象であります。 プロシージャの下のピークを揃える >構成ビュー。 3.0 を入力正規化ビューの下の正規化を実行Rg値として nm。 バンドを広げる同じ構成] タブ、[ピークを選択し、実行に合わせてボタンを使用して、RI 信号に UV と LS 信号に一致します。 結果のグラフは、フィッティング結果ビューに表示されます。グラフを右クリックし、編集を選択、[詳細設定] ボタンをクリックして軸スケールなどのグラフのパラメーターを変更します。詳細表示オプションのグラフ図もEASI グラフ] タブで利用可能です:モル質量をウィンドウの上部を表示ドロップ ダウン メニューから選択します。 モル質量、半径、純度、等を含むすべての結果がレポートビュー (要約または詳細) [結果] セクションの下に利用可能なことに注意してください。詳細の結果またはパラメーターとしての数字をレポートに追加するのにレポート デザイナー ] ボタンを使用します。