Cromatografia a scambio ionico (IEX) accoppiata alla diffusione della luce multi-angolo (MALS) per la caratterizzazione e la separazione delle proteine

1. preparazione del sistema Installare il sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) di proteine veloci e MALS/refrattiva rivelatori di indice (RI) (Vedi Tabella materiali) insieme a loro rispettivi pacchetti per controllo, acquisizione dati e analisi per i costruttori istruzioni. Collegare i rilevatori di Malles Venosta e RI a valle di rivelatori UV e la conducibilità di FPLC. Escludere il sensore di pH a meno che non è assolutamente necessario per gradienti di pH, per ridurre al minimo il volume interdetector tra i rilevatori UV e Malles Venosta. Utilizzare tubazione capillare di 0,25-0,5 diametro mm interno (i.d.) tra la colonna e rivelatori e tubazione capillare di 0,75 mm i.d. sull’uscita del rivelatore RI al raccoglitore rifiuti o frazione. Assicurarsi che le connessioni di segnale necessario tra il FPLC e rivelatori sono state stabilite, tra cui un’uscita analogica UV dal rilevatore FPLC all’ingresso Aux Malles Venosta e uscita digitale dal FPLC al MALS Autoinject, tramite la casella dei / o. 2. preparazione del campione e del buffer Filtrare tutti i reagenti, tra cui i buffer di lavaggio e di eluizione, con un filtro 0,1 µm. Filtrare i primi 50 – 100 mL di tampone in una bottiglia dei rifiuti al fine di eliminare il particolato da filtri a secco e mantenere il resto del buffer in una bottiglia pulita e sterile che è stato accuratamente lavata con acqua filtrata e ridotta per impedire l’ingresso di polvere. Regolare un campione di BSA per un pH e forza ionica (ad es., pH = 8, 50 mM NaCl) che consentire l’associazione alla colonna IEX durante la diluizione, ultrafiltrazione o procedure di scambio di buffer.Nota: Si consiglia di prefiltrare il campione della proteina per il più piccolo formato del poro che non rimuove il materiale di interesse (0,02 – 0,1 µm). In alternativa, il campione può essere centrifugato ad alta velocità (13.000 – 16.000 x g) per 10 minuti consentire la precipitazione di particelle di grandi dimensioni. Preparare almeno 0,3 – 0,5 mg di BSA (Vedi Tabella materiali) per iniettare in una colonna di 1 mL (5/50 mm) per realizzare un’analisi di Malles Venosta di buona qualità. Si noti che il volume di iniezione è illimitato. 3. scelta e lo sviluppo di un metodo IEX per una proteina Calcolare il punto isoelettrico (pI) della proteina basata sulla sequenza primaria, per i quali server come strumento di Protparam sulla ExPASy sito Web può essere usato15. Si noti che il pI di BSA è 5.8. Selezionare i parametri di tipo e buffer di colonna. Utilizzare diversi buffer per AIEX e CIEX, a seconda il pK del buffer e la natura ionica del buffer. Utilizzare i buffer cationici quando si esegue la colonna AIEX e anionici buffer quando si esegue la colonna CIEX con piccoli controioni. In questo esempio, utilizzare buffer 20 mM Tris-HCl, pH 8, per l’analisi di BSA su una colonna AIEX. Per una proteina con un pI inferiore a 7, come BSA, utilizzare una colonna AIEX e tampone con un pH superiore al pI da almeno due unità. Per una proteina con un pI superiore a 7, è possibile utilizzare una colonna CIEX e buffer con un pH inferiore al pI di proteine da almeno due unità. Ottimizzare il tampone pH secondo la forza del legame tra la proteina e la matrice di colonna. Se una proteina non legano bene alla colonna, utilizzare un pH più lontano il pI. Assicurarsi che la proteina è stabile al pH usato. Utilizzare una bassa concentrazione di sale nell’associazione e lavare i buffer per consentire l’associazione della proteina alla matrice, dal momento che il legame alle proteine dipende la forza ionica del campione caricato. Proteine di solito richiedono un po’ di sale per la loro stabilità; Pertanto, utilizzare 50 mM NaCl (o sale alternativi) durante i passaggi di proteina-caricamento e lavare a colonna. Per tampone di eluizione, utilizzare un massimo di 0,5 M NaCl per scollegare la proteina dalla colonna.Nota: Più alte concentrazioni di sale non sono consigliate quando si lavora con il rifrattometro RI modello standard a causa della limitazione di gamma dello strumento. Tuttavia, un modello di alta concentrazione può essere utilizzato e ospiterà 2 M NaCl. Eseguire un metodo iniziale come segue. Caricare 1 mg di BSA (170 µ l di 6 mg/mL) in ~0.5 mL di un tampone di caricamento del buffer di 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenente 50 mM NaCl. Lavare la colonna con lo stesso buffer per un volume di colonna di 10 – 15 (CV) consentire la completa eluizione delle molecole non associati e particelle dal sistema fino a quando la dispersione della luce (LS), UV, e RI segnali sono completamente stabilizzati. Eseguire una sfumatura lineare, breve sale di 20 – 30 CV, usando il tampone di eluizione di 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenenti 0,5 M NaCl per staccare la proteina dalla colonna. Eseguire una sfumatura di 0 – 100% (o alternativa diffusa sfumatura) del buffer di eluizione o dividerlo in due sfumature: 0 – 50% di tampone di eluizione seguita da un’ulteriore sfumatura di 50 – 100% di tampone di eluizione, ogni sfumatura per 10 – 20 CV. Per BSA, usare un gradiente diffuso del 15% – 70% per 30 CV per il metodo iniziale.Nota: In alcuni casi, il metodo iniziale può fornire separazione per un’analisi affidabile di Malles Venosta e piste aggiuntive non sono necessarie. In molti casi, il metodo iniziale fornisce solo indicazioni per ulteriore ottimizzazione del metodo. Ottimizzare il metodo IEX per aumentare la risoluzione e migliorare la separazione dei picchi modificando parametri diversi. Modificare la pendenza pendenza e la lunghezza. Breve gradienti con pendenze elevate forniscono intensi picchi con meno separazione, mentre lunghi gradienti con lievi pendii inferiore picchi con una separazione migliore. Trovare un equilibrio tra intensità di segnale e risoluzione di picco per l’analisi di Malles Venosta ottimale.Nota: Caricamento di una maggiore quantità di proteine può aumentare LS, UV, e RI segnali ma ciò a scapito della risoluzione. Utilizzare un profilo graduale concentrazione salina per l’eluizione. Ricorda che una combinazione di passi e sfumatura lineare viene utilizzata comunemente. Diminuire la portata per migliorare la separazione dei picchi.Nota: Per matrici con particelle molto piccole, questo non è molto significativo. Modificare il pH del tampone per la variazione di carica tra le popolazioni della proteina nel campione di aumentare e migliorare la separazione tra quelle varianti. Nota che le proteine che non sono adeguatamente separate a un pH possono essere separate a pH diversi. Utilizzare un pH gradiente, lineare o graduale, per scollegare proteine dalla colonna IEX. Utilizzare i gradienti di eluizione che combinano pH e variazioni di concentrazione di sale se necessario. Utilizzare sali più forte, ad esempio MgCl2o sali più deboli, come l’acetato del sodio, per aumentare sensibilità e risoluzione16. Utilizzare una matrice colonna diversa o più IEX colonne con particelle più piccole di migliorare capacità di separazione. Modificare il tipo di colonna (AIEX/CIEX) per fornire un diverso modello di separazione. Nota che matrici con forte, debole o combinati ligandi (modalità mista) sono inoltre disponibili e possono migliorare la risoluzione di alcuni campioni. Utilizzare una colonna da un fornitore diverso con il ligando stesso che è attaccato alle resine di matrice diversa. La resina stessa, indipendentemente dal ligando, può interagire diversamente con le proteine e influiscono sul profilo di separazione. Sono additivi (molecole che stabilizzano le proteine nella soluzione) nei buffer per migliorare la stabilità delle proteine ed evitare l’aggregazione proteica, per migliorare l’esperimento IEX.Nota: Gli esempi di tali additivi sono alcoli, urea, zuccheri, detergenti non ionici o zwitterionici e17,18di sali caotropici e kosmotropic. 4. esperimento IEX-Malles Venosta Aprire New\Experiment dal metodo nel software Malles Venosta e selezionare il metodo online dalla cartella dei metodi del sistema di Light Scattering . Se è disponibile il modulo DLS e DLS dati devono essere acquisiti, è possibile selezionare il metodo online dalla sottocartella QELS Scattering\With luce . Impostare i parametri di funzionamento sotto la sezione di configurazione . Impostare la portata della corsa nella sezione Pompa generico per il tasso di flusso utilizzato in FPLC (1,5 mL/min) e immettere o verificare i parametri del buffer nella sezione di solvente . Immettere il nome di proteina (BSA), incremento di indice di rifrazione (dn/dc; lo standard valore per le proteine è 0,185 mL/g), coefficiente di estinzione UV a lunghezza d’onda di 280 nm (0,66 g/L-1ma-1) e la concentrazione del campione della proteina (6 mg/mL) in la scheda di esempio nella sezione iniettore . Inserire il volume del campione per l’iniezione (170 µ l) come pure nella stessa sezione. Nella scheda Collezione Basic , nella sezione procedura , selezionare la casella di controllo Trigger su Autoinject e impostare la durata dell’esecuzione in modo che la raccolta dati sarà continuata per almeno 5 min dopo che ha raggiunto il gradiente relativo valore finale. Impostare i parametri di esperimento nel software FPLC. Creare un nuovo esperimento nella scheda Editor di metodo . L’esperimento iniziale sarà una sfumatura lineare di sale o di pH (Vedi punto 3.3). Per il metodo ottimizzato, creare una sfumatura più specifica o un programma graduale in base ai risultati di eluizione durante il metodo iniziale (Vedi punto 3.4 e Figura 1). Sono un segnale di impulso nel metodo che attiverà la raccolta di dati del software di Malles Venosta. Lavare la colonna e valvole con i relativi buffer: 20 mM Tris-HCl, pH 8, con 50 mM NaCl per il tampone di lavaggio (una valvola) e lo stesso buffer con 500 mM NaCl per il buffer di eluizione (valvola di B). Assicurarsi che il lavaggio finale colonna utilizza il buffer di associazione, contenente una bassa concentrazione di sale, per attivare l’associazione della proteina alla matrice colonna. Per un lavaggio massiccio delle impurità fortemente associati, è necessario utilizzare 0,5 M NaOH prima di lavare con i relativi buffer, seguiti da una lavatura di tampone di neutralizzazione. Posto il campione della proteina nel ciclo usando una siringa. Se più di 10 mL di campione viene caricato, è possibile utilizzare un superloop o la pompa-valvola dello strumento FPLC, aggirando la pompa del filtro e il mixer del FPLC. Prima di avviare l’esperimento nel software Malles Venosta facendo clic sul pulsante Esegui e poi nel software FPLC. I dati saranno raccolti dopo la ricezione del segnale di impulso dallo strumento FPLC attraverso il rilevatore di Malles Venosta. Si applicano gli stessi parametri Esegui le istruzioni descritte nei passaggi 4.1 – 4.4 se IEX-Malles Venosta viene eseguita manualmente con una modalità flusso continuo anziché un metodo autonomo. Dopo aver verificato ed eseguito il metodo finale, eseguire esattamente lo stesso metodo con un’iniezione in bianco (buffer di caricamento anziché il campione). È importante che i tempi tra l’impulso di autoinject e la sfumatura dell’esecuzione del vuoto sono identico a quello dell’esecuzione dell’esempio. 5. analisi dei dati sperimentali IEX-Malles Venosta Eseguire l’analisi passo per passo nella sezione procedura del software di Malles Venosta. La Collezione Basic visualizzare la raccolta di dati grezzi dell’esperimento. Utilizzare la scheda Despiking per lisciare i cromatogrammi se esibiscono un sacco di rumore. Normalmente, si usa il livello normale . Definire la linea di base per tutti i segnali (tutti LS, UV e RI rivelatori) nella visualizzazione della linea di base . Definire le cime per analisi nella vista vette . Verificare i valori corretti di dn/dc e del coefficiente di estinzione UV per la proteina sotto ogni picco.Nota: Per le proteine, è comune utilizzare un valore di incremento di RI standard di 0,185 mL/g, ma per altre macromolecole, dn/dc diversi valori devono essere utilizzati, secondo la natura della molecola. Il dn/dc medio di polinucleotidi (DNA/RNA) è 0,17 mL/g19, mentre saccaridi, come saccarosio, hanno un valore medio dn/dc di 0,145 mL/g20 e i valori di dn/dc di lipidi e detersivi compresi tra 0,1-0,16 mL/g21. Analizzare la massa molare e il raggio utilizzando i parametri di montaggio e la funzione di correlazione sotto la massa molare & raggio da LS e Rh da QELS visualizzazioni. I cambiamenti del segnale RI significativamente durante la IEX-MALS eseguire dovuto l’aumento nella concentrazione di sale. Quindi sottrarre il segnale di linea di base dall’iniezione in bianco per i calcoli di massa che richiedono dati RI. Aprire sia la proteina ed il vuoto IEX-MALS esperimenti. Pulsante destro del mouse sul nome di esperimento della proteina, selezionare Metodo di applicaree scegliere la cartella di Sottrazione della linea di base nella finestra di dialogo file. Selezionare il tipo corretto di metodo (ad esempio, online) per analisi di massa molare standard. Si noti che i parametri e le impostazioni definite per l’esperimento di proteina verranno salvate il nuovo metodo aperto. Sotto la vista di Sottrazione della linea di base , fare clic su Importazione vuoto per importare i segnali dell’esecuzione del vuoto. Nell’ambito di strumenti (accanto al pulsante di Importazione in bianco ), controllare tutti i rivelatori per sottrarre. Nella vista vette , è possibile regolare i valori di dn/dc (se necessario) a causa della conducibilità della soluzione presso l’area del picco della proteina, poiché l’indice di rifrazione della soluzione viene modificato durante l’esecuzione di12. Calibrare il sistema IEX-MALS con monomero di BSA.Nota: Normalmente, il sistema IEX-MALS periodicamente è calibrato per allineamento di picco, ampliando la banda e la normalizzazione dei rivelatori angolari per il rilevatore di 90° utilizzando una proteina monodispersi con un raggio di girazione (Rg) di < 10 nm, come monomero di BSA. In questo esempio, BSA serve sia come la molecola di calibrazione ed è essa stessa oggetto di analisi di massa molare. Allineare le cime, nell’ambito delle procedure > visualizzazione configurazione . Eseguire la normalizzazione sotto la vista di normalizzazione , entrando 3.0 nm come il valore dig R. Sotto Ampliando la banda nella stessa scheda configurazione , scegliere il picco e abbinare i segnali UV e LS per il segnale di RI, utilizzando il tasto Eseguire Fit . Il grafico dei risultati viene visualizzato nella visualizzazione Risultati raccordo . Modificare le scale asse e altri parametri del grafico facendo clic destro sul grafico, selezionando Edite quindi facendo clic sul pulsante Avanzate . Una figura di grafico con più opzioni di visualizzazione è anche disponibile nella scheda Grafico EASI : Massa molare di selezionare dal menu a discesa Visualizza nella parte superiore della finestra. Si noti che tutti i risultati, tra cui massa molare, raggio, livello di purezza e altri, sono disponibili nella visualizzazione Report (riepilogo o dettagliata) sotto la sezione risultati . Utilizzare il pulsante di Progettazione Report per aggiungere ulteriori risultati o parametri, nonché figure, la relazione.