Chromatographie d’échange ionique (IEX) couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (MALS) pour la caractérisation et la séparation de protéines

1. préparation du système Installer le système de chromatographie liquide (FPLC) protéine rapide et MALS/réfraction détecteurs index (RI) (voir la Table des matières) ainsi que leurs logiciels respectifs pour contrôle d’acquisition de données et analyse par les manufacturiers instructions. Connecter les détecteurs MALS et RI en aval de détecteurs d’UV et de la conductivité de la FPLC. Contourner le détecteur de pH à moins qu’il est absolument nécessaire pour des gradients de pH, afin de minimiser le volume d’interdetector entre les détecteurs UV et MALS. Utilisez des tubes capillaires de 0,25 à 0,5 mm diamètre (d.i.) entre la colonne et de détecteurs et de tube capillaire, i.d. 0,75 mm à la sortie du détecteur RI au collecteur de déchets ou de la fraction. Veiller à ce que les branchements nécessaires entre les FPLC et détecteurs ont été établis, y compris une sortie analogique UV du détecteur à l’entrée Aux MALS FPLC et sortie numérique de la FPLC au MALS Autoinject In, par l’intermédiaire de la boîte d’e/s. 2. préparation de l’échantillon et le tampon Filtrer tous les réactifs, y compris les tampons de lavage et d’élution, avec un filtre de 0,1 µm. Filtrer les premiers 50 – 100 mL de tampon dans une bouteille pour eaux usées afin d’éliminer les particules des filtres secs et garder le reste de la mémoire tampon dans une bouteille propre et stérile qui a été lavée avec de l’eau filtrée et plafonnée pour empêcher la poussière d’entrer. Ajuster un échantillon de BSA à un pH et la concentration ionique (p. ex., pH = 8, 50 mM NaCl) qui permettent la liaison à la colonne IEX au cours de la dilution, l’ultrafiltration ou procédures d’échange de mémoire tampon.Remarque : Il est recommandé de préfiltrer l’échantillon de protéines à la taille des pores plus petite qui ne supprime pas les documents d’intérêt (0,02 à 0,1 µm). Alternativement, l’échantillon peut être centrifugé à haute vitesse (13 000 à 16 000 x g) pendant 10 min permettre à la précipitation de grosses particules. Préparer au moins 0,3 à 0,5 mg de BSA (voir Table des matières) pour l’injecter dans une colonne de 1 mL (5/50 mm) pour la réalisation d’une analyse MALS de bonne qualité. Notez que le volume d’injection est illimité. 3. choix et élaboration d’une méthode IEX pour une protéine Calculer le point isoélectrique (pI) de la protéine basé sur la séquence principale, pour quels serveurs comme outil de Protparam sur l’ExPASy site Web peut être utilisé15. Notez que le pI de BSA est de 5,8. Sélectionnez les paramètres de type et de la mémoire tampon de colonne. Utiliser différents tampons pour AIEX et CIEX, selon le pKun de la mémoire tampon et la nature ionique de la mémoire tampon. Utilisez cationiques tampons lors de l’exécution de la colonne AIEX et anioniques tampons lors de l’exécution de la colonne CIEX avec petites contre-ions. Dans cet exemple, utilisez un tampon 20 mM Tris-HCl, pH 8, pour l’analyse des BSA sur une colonne AIEX. Pour une protéine avec un pI inférieur à 7, tels que le BSA, utilisez une colonne AIEX et tampon dont le pH est plus élevé que le pI par au moins deux unités. Pour une protéine dont le pI supérieur à 7, utilisez une colonne CIEX et tampon dont le pH est inférieur à la pI de la protéine par au moins deux unités. Optimiser le pH tampon selon la force de liaison entre la protéine et la matrice de la colonne. Si une protéine ne lie pas bien à la colonne, utilisez un pH plus éloigné de la pI. Assurez-vous que la protéine est stable au pH utilisé. Utilisez une faible concentration de sel dans la liaison et laver les tampons pour autoriser la liaison de la protéine de la matrice, puisque la liaison aux protéines dépend de la force ionique de l’échantillon chargé. Protéines exigent habituellement peu de sel pour leur stabilité. par conséquent, utiliser 50 mM NaCl (ou autre sel) au cours des étapes de protéine-chargement et colonne de lavage. Pour la mémoire tampon d’élution, utilisez un maximum de 0,5 M de NaCl pour détacher la protéine de la colonne.Remarque : Des concentrations plus élevées de sels ne sont pas recommandées lorsque vous travaillez avec le réfractomètre de RI-modèle standard en raison de la limitation de la portée de l’instrument. Toutefois, un forte concentration modèle peut être utilisé et peuvent accueillir 2 M NaCl. Exécuter une méthode initiale comme suit. Charge 1 mg de BSA (170 µL de 6 mg/mL) dans ~0.5 mL d’un tampon de charge d’un tampon 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenant 50 mM NaCl. Laver la colonne avec le même tampon pour un volume de colonne de 10 – 15 (CV) permettre l’élution complète des molécules non liés et particules du système jusqu’à la diffusion de la lumière (LS), UV, et RI signaux sont entièrement stabilisées. Effectuer un dégradé court, linéaire de sel de 20 à 30 CV, à l’aide de la mémoire tampon d’élution de 20 mM Tris-HCl, pH 8, contenant 0,5 M de NaCl pour détacher la protéine de la colonne. Réaliser une pente de 0 à 100 % (ou gradient généralisé alternative) du tampon d’élution ou la diviserait à deux gradients : 0 – 50 % de la mémoire tampon d’élution suivie d’un gradient supplémentaire de 50 – 100 % de la mémoire tampon d’élution, chaque dégradé pour 10 à 20 CV. Pour BSA, utiliser un dégradé très répandu de 15 % à 70 % pour les 30 CV pour la méthode initiale.Remarque : Dans certains cas, la méthode initiale peut assurer l’espacement pour une analyse fiable des MALS et pistes supplémentaires ne sont pas nécessaires. Dans de nombreux cas, la méthode initiale apporte seulement pour l’optimisation de la méthode supplémentaire. Optimiser la méthode IEX pour augmenter la résolution et d’améliorer la séparation pointe en modifiant les différents paramètres. Modifier la pente gradient et la longueur. Dégradés courts avec des pentes élevées fournissent des pics intenses avec un espacement de moins, tandis que longs dégradés avec des pentes douces fournissent pics inférieurs avec meilleure séparation. Trouver l’équilibre entre l’intensité maximale de résolution et de signal pour l’analyse optimale des MALS.Remarque : Une plus grande quantité de protéine de chargement peut augmenter LS, UV, et RI signaux mais le fait au détriment de la résolution. Utiliser un profil de concentration saline par étapes pour l’élution. N’oubliez pas qu’une combinaison de mesures et de dégradé linéaire est couramment utilisée. Diminuer le débit afin d’améliorer la séparation des pics.Remarque : Pour les matrices avec de très petites particules, ce n’est pas très important. Changer le pH tampon pour augmenter la variation de la charge entre les populations de protéines dans l’échantillon et d’améliorer la séparation entre ces variantes. Notez que les protéines qui ne sont pas séparées correctement à un pH peuvent être séparées à un pH différent. Utilisez un pH gradient, linéaire ou par étapes, pour détacher les protéines de la colonne IEX. Utilisez des gradients d’élution qui combinent le pH et les variations de concentration en sel si nécessaire. Des sels plus forts, tels que le MgCl2ou sels plus faibles, tels que l’acétate de sodium permet d’augmenter la sensibilité et la résolution16. Utilisation plus longue IEX colonnes ou une matrice colonne différente avec des particules plus petites pour améliorer les capacités de séparation. Changer le type de colonne (AIEX/CIEX) pour fournir un modèle différent de la séparation. Notez que les matrices avec fortes, faibles ou combinées des ligands (mode mixte) sont également disponibles et peuvent améliorer la résolution de certains échantillons. Utiliser une colonne d’un fournisseur différent avec le même ligand qui est attaché aux résines de matrice différente. La résine elle-même, indépendamment du ligand, peut interagir différemment avec les protéines et affectent le profil de séparation. Inclure les additifs (molécules qui stabilisent la protéine dans la solution) dans les mémoires tampons pour améliorer la stabilité des protéines et éviter l’agrégation des protéines, afin d’améliorer l’expérience IEX.Remarque : Sont des exemples de tels additifs détergents non ioniques ou zwitterioniques, urée, alcools, sucres et sels de chaotropes et kosmotropic17,18. 4. IEX-MALS expérimenter Ouvrez New\Experiment de méthode dans le logiciel MALS et sélectionnez la méthode en ligne dans le dossier de méthodes de système de Diffusion de la lumière . Si le module de listes de distribution est disponible et données DLS doivent être acquis, sélectionnez la méthode en ligne dans le sous-dossier de Lumière Scattering\With QELS . Définissez les paramètres de la course au titre de la section de Configuration . Régler le débit de fuite dans la section Générique pompe au débit utilisé dans le FPLC (1,5 mL/min), puis entrez ou vérifiez les paramètres de mémoire tampon dans la section de solvant . Entrez le nom de protéine (BSA), indice de réfraction (dn/dc, la norme est de valeur pour les protéines 0,185 mL/g), coefficient d’extinction UV à la longueur d’onde de 280 nm (0,66 g/L-1·cm-1) et la concentration de l’échantillon de protéines (6 mg/mL) en l’onglet d’échantillon en vertu de la section de l’injecteur . Insérez le volume de l’échantillon pour injection (170 µL) aussi bien dans la même section. Dans l’onglet de la Collection de base , en vertu de la section de la procédure , cochez la case détente sur Autoinject et régler la durée de la course afin que la collecte de données se poursuivra pendant au moins 5 min après le gradient a atteint son valeur finale. Définissez les paramètres de l’expérience dans le logiciel FPLC. Créer une nouvelle expérience dans l’onglet Éditeur de méthode . L’expérience initiale sera un dégradé linéaire de sel ou de pH (voir l’étape 3.3). Pour la méthode optimisée, créer un dégradé plus spécifique ou un programme par étapes selon les résultats d’élution pendant la méthode initiale (voir étape 3.4 et Figure 1). Inclure une impulsion dans la méthode qui déclenchera la collecte de données dans le logiciel MALS. Laver la colonne et des robinets avec les tampons pertinentes : 20 mM Tris-HCl, pH 8, avec 50 mM NaCl pour le tampon de lavage (une vanne) et le même tampon avec 500 mM NaCl pour la mémoire tampon d’élution (vanne B). Assurez-vous que le lavage de la dernière colonne utilise le tampon de liaison, contenant une faible concentration de sel, pour permettre la liaison de la protéine de la matrice colonne. Pour un lavage massif des impuretés fortement liés, utilisez 0,5 M NaOH avant de vous laver avec les tampons pertinentes, suivies d’un lavage de tampon de neutralisation. Placer l’échantillon de protéine dans la boucle à l’aide d’une seringue. Si plus de 10 mL de l’échantillon est chargé, utilisez un superloop ou la pompe-valve de l’instrument FPLC tout en contournant la pompe du filtre et le mélangeur de la FPLC. Commencez tout d’abord l’expérience dans le logiciel MALS en cliquant sur le bouton exécuter , puis dans le logiciel FPLC. On recueillera des données après avoir reçu le signal d’impulsion de l’instrument FPLC via le détecteur MALS. Appliquer les mêmes paramètres de la course et les instructions décrites aux points 4.1 à 4.4 si l’IEX-MALS est exécutée manuellement avec un mode de flux continu au lieu d’une méthode autonome. Une fois que la dernière méthode a été vérifiée et exécute, effectuer exactement la même méthode à l’aide d’une injection de vide (tampon de charge au lieu de l’échantillon). Il est important que le timing entre le pouls de l’autoinject et la pente de la piste vide est identique à celle des échantillons. 5. l’analyse des données expérimentales IEX-MALS Effectuer l’analyse étape par étape, en vertu de la section de la procédure dans le logiciel MALS. La vue de Collection de base affiche la collection de données brutes de l’expérience. Utilisez l’onglet Despiking pour lisser les chromatogrammes si elles présentent beaucoup de bruit. Normalement, utilisez le niveau normal . Définir le niveau de référence pour tous les signaux (tous LS, UV et IR détecteurs) dans l’affichage de la ligne de base . Définir les pics pour l’analyse de l’affichage des sommets . Vérifiez les valeurs correctes de dn/dc et le coefficient d’extinction UV pour la protéine sous chaque pic.Remarque : Pour les protéines, il est courant d’utiliser une valeur d’incrément RI standard de 0,185 mL/g, mais d’autres macromolécules, dn/dc différentes valeurs devraient être utilisées, selon la nature de la molécule. La moyenne dn/dc de polynucléotides (ADN/ARN) est de 0,17 mL/g19, tandis que saccharides, tels que saccharose, ont une valeur moyenne dn/dc 0,145 mL/g20 et les valeurs de dn/dc des lipides et détergents varient entre 0,1 – 0.16 mL/g21. Analyser la masse molaire et le rayon en utilisant les paramètres d’ajustement et la fonction de corrélation sous le point de vue de masse molaire & rayon de LS et Rh de QELS . Les modifications de signal RI significativement durant l’IEX-MALS exécutent en raison de l’augmentation de la concentration en sel. Par conséquent, soustraire le signal de base de l’apport de blanc pour les calculs de massives qui requièrent des données de RI. Ouvrir la protéine et des expériences IEX-MALS blancs. Faites un clic droit sur le nom d’expérience de protéine, sélectionnez la Méthode à appliqueret choisir le dossier de la Soustraction de la base de la boîte de dialogue fichier. Sélectionnez le bon type de méthode (par exemple, en ligne) pour une analyse de masse molaire standard. Notez que les paramètres et les paramètres définis pour l’expérience de la protéine seront sauvegardés sur la nouvelle méthode ouverte. En vertu de l’avis de la Soustraction de la ligne de base , cliquez sur Vide importer pour importer les signaux de la course blanche. En vertu d’ Instruments (à côté du bouton Import vierge ), vérifier tous les détecteurs à soustraire. De l’avis de pics , ajuster les valeurs de dn/dc (si nécessaire) en raison de la conductivité de la solution à la surface de pic de protéine, puisque le RI de la solution est modifié pendant l’ exécution de12. Calibrer le système IEX-MALS avec monomère de BSA.Remarque : Normalement, le système IEX-MALS est étalonné périodiquement pour l’alignement de la pointe, élargissement de la bande et de la normalisation des détecteurs angulaires au détecteur 90° grâce à une protéine monodispersés avec un rayon de giration (Rg) de < 10 nm, comme monomère de BSA. Dans cet exemple, BSA sert aussi bien que la molécule de calibration et lui-même fait l’objet de l’analyse de masse molaire. Aligner les pics, conformément aux procédures > vue de Configuration . Effectuer la normalisation sous la vue de la normalisation , entrant 3,0 nm comme la valeur deg R. Au titre de l’ Élargissement de la bande dans le même onglet de Configuration , choisissez le pic et correspondre les signaux UV et LS au signal RI, en utilisant le bouton Exécuter Fit . Le graphique des résultats s’affiche dans la vue Montage de résultats . Changer l’échelle de l’axe et d’autres paramètres du graphique en faisant un clic droit sur le graphique, choisissez modifieret puis en cliquant sur le bouton avancé . Une figure graphique avec plusieurs options d’affichage est aussi disponible dans l’onglet Graphique EASI : sélectionnez La masse molaire dans le menu déroulant Afficher en haut de la fenêtre. Notez que tous les résultats, y compris la masse molaire, rayon, degré de pureté et d’autres, sont disponibles dans la vue de rapport (sommaire ou détaillée) en vertu de la section résultats . Le bouton Générateur de rapports permet d’ajouter plus de résultats ou de paramètres, ainsi que des chiffres, le rapport.