التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف
Summary
ويصف هذا البروتوكول استخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني عالية الدقة مع تشتت الضوء زاوية المتعددة من أجل تحديد كتلة مولى دقيق من البروتينات والبروتين المجمعات الببتيدات في عينة غير متجانسة. هذا الأسلوب قيمة لتقييم الجودة، وكذلك فيما يتعلق بتوصيف ليغومرات الأصلية، ومتغيرات التهمة، وعينات مختلطة من البروتين.
Abstract
التبادل الأيوني اللوني مع تشتت الضوء زاوية المتعددة (المستوى-مالس) وسيلة قوية لفصل البروتين وتحديد خصائصها. الجمع بين تقنية فصل خصوصية عالية المستوى مع التحليل الشامل المولى دقيقة حققها مالس يسمح توصيف عينات البروتين غير متجانسة، بما في ذلك مخاليط من أشكال أوليجوميريك أو البروتين بالسكان، حتى مع جداً الجماهير المولى مماثلة. ولذلك، مالس المستوى يوفر مستوى إضافي من توصيف البروتين ويكمل اللوني استبعاد حجم قياسي مع تقنية تشتت الضوء زاوية المتعددة (SEC-مالس).
هنا يمكننا وصف بروتوكول التجربة المستوى أساسي-مالس وإثبات هذا الأسلوب في ألبومين المصل البقري (BSA). المستوى يفصل بين جيش صرب البوسنة بأشكاله أوليجوميريك، مما يتيح إجراء تحليل شامل مولى حسب مالس لكل شكل من أشكال الفردية. كما قدم الأمثل لتجربة مالس المستوى وبرهنت على جيش صرب البوسنة، تحقيق الانفصال ممتازة بين جيش صرب البوسنة مونومرات وليغومرات أكبر. مالس المستوى هو تقنية قيمة لتقييم نوعية البروتين نظراً لأنه يوفر الفصل غرامة والعزم الجماعي المولى متعددة الأنواع البروتين الموجودة في عينة.
Introduction
الوصف الكمي لمنتجات البروتين الضروري متزايدة كوسيلة لمراقبة النوعية (QC)، سواء لأغراض تنظيمية في الصناعة الصيدلانية البيولوجية، وضمان موثوقية وسلامة علوم الحياة البحث1 , 2-كما هو موضح في مواقع ويب الخاصة بالبروتين شبكات إنتاج البروتين، وتنقية الشراكة في أوروبا (P4EU) ورابطة للموارد للبحوث الفيزيائية الحيوية في أوروبا والفيزياء الحيوية الجزيئية في أوروبا (أربر-مبايو) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs و https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control، على التوالي)، البروتين ومراقبة الجودة يجب أن يتسم بها ليس فقط نقاء المنتج النهائي، ولكن أيضا حالته oligomeric والتجانس والهوية، تكيف والهيكل وتعديلات بوستترانسلاشونال والأخرى3،خصائص4.
أحد أساليب توصيف QC الأكثر شيوعاً هو مالس ثانية. في هذا الأسلوب، يقترن عمود ثانية تحليلية إلى مالس والكشف عن سبيكتروفوتوميتريك وريفراكتوميتريك وتمكين قياسات دقيقة من البروتين كتلة المولى كل ذروة5. تحدد كتلة المولى من قمم الوتيد مستقلة عن حجم شطف ثانية مالس ويتغلب على عدم دقة تحليلية في الثانية باستخدام معايرة العمود. إضافة وحدة نمطية (DLS) نثر الضوء الديناميكي يضيف قدرة قياس حجم يسمح تصميم هيدرودينامية دائرة نصف قطرها. في البحوث الأكاديمية، مالس ثانية يستخدم عادة لتحديد حالة oligomeric بروتين، المطابقة، ومستوى النقاء، مستوى التجميع، وتعديل البروتينات، مثل جليكوبروتينس أو بروتينات الغشاء solubilized الدهن (تحديد كتلة المولى من البروتين ومترافق المكونات منفردة)6،،من78.
في كثير من الحالات، ليست أنواع جزيئية جيدا-defined البروتين النهائي لعملية تنقية لكن بدلاً من ذلك وتضم بعض التباين. يمكن أن تختلف البروتينات في خليط من هذا القبيل فيما يتعلق بهيكل (على سبيل المثال، مختلف أشكال oligomeric) أو والتشكلات isoforms البروتين. يمكن أيضا أن عدم تجانس البروتين نتيجة للاختلافات الطفيفة الكيميائية الناجمة عن تجهيز يسين ج–المحطة الطرفية أو deamination الهليونين/الجلوتامين، مما أدى إلى اتهام تباين9،10. الاختلافات في التعديلات بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن يؤدي أيضا إلى عينات متجانسة مع اختلافات مقابل9. هذه الأنواع المختلفة من عدم التجانس وتنعكس في الخصائص الفيزيائية للبروتين ويمكن أن تؤثر على الاستقرار والنشاط البيولوجي ل البروتين الهدف11.
تتطلب فحوصات مراقبة الجودة يمكن الاعتماد عليها لمثل هذه العينات غير متجانسة تقنية فصل تحليلي فبدرجة عالية. وهناك حالات حيث يمكن الطعن في فصل جيدة لتحقيق مع أعمدة ثانية التحليلية، سبب بهم محدودة القرار وفصل قدرات12، أسفر معيبة مالس ثانية تحليل. الجمع بين تقنية فصل خصوصية عالية مثل المستوى مع مالس يمكن التغلب على الحد مالس ثانية في عينات غير متجانسة وتوفير وسيلة تكميلية لتوصيف البروتين (الجدول 1 في أمارتيلي et al.12). خلافا للبورصة، التي تفصل بين الجزيئات الكبيرة الحجم الهيدروديناميكي13، يفصل المستوى الجزيئات الكبيرة بهذه التهمة السطحية14. تبادل شاردة (عيش) وربط مصفوفات تبادل الأيونات الموجبة (سي) سلبا وايجابا اتهم المتغيرات، على التوالي. مع غرامة فصل بين السكان البروتينات التي تشترك في كتلة قريبة نسبيا أو الشكل، يحدد المستوى-مالس بنجاح كتلة المولى لكل دولة فردية البروتين في عينة خليط12.
وهنا يقدم بروتوكول قياسي لتشغيل تجربة المستوى-مالس لفصل وتحليل أشكال oligomeric جيش صرب البوسنة التي توجد في نفس العينة. اختيار عمود المستوى لبروتين محددة المهم ومناقشته، فضلا عن ظروف الأس الهيدروجيني والتوصيل من المخازن المؤقتة. كما يتم وصف تحليل البيانات التجريبية المستوى مالس خطوة بخطوة. على الرغم من أن الفصل بين جيش صرب البوسنة ليغومرات جيدة وكافية في ثانية-مالس، جيش صرب البوسنة مثال جيد لإظهار قدرات المستوى-مالس وإثبات الاستغلال الأمثل للتجربة. وتجري مناقشة الأمثلة الفقراء العزل حققتها ثانية مالس والفصل السليم والتحليل مكن من المستوى-مالس في دراسة سابقة12.
Protocol
Representative Results
Discussion
مالس المستوى هو وسيلة قوية لفصل البروتين وتوصيف يسمح تصميم الشامل المولى دقيقة من البروتينات الصرفة كذلك اعتبارا من عينات غير المتجانسة، تميز الأصلي ليغومرات، المجاميع غير الأصلية، التساهمية ونونكوفالينت المجمعات، والبروتينات كونجوجاتيد. يمكن لبرنامج يتألف من تدرج خطي أو سلسلة من الخطوات تركيز الملح تحقيق فصل جيدة للسكان البروتين والسماح بتحليل مناسب لكل ذروة الفردية قبل مالس. التحسين إضافية قبل متفاوتة معلمات مختلفة، مثل التدرج المنحدر (راجع الخطوة 3، 4 من البروتوكول)، ويمكن أن يؤديها إذا كان مطلوباً حل أفضل. مالس المستوى يمكن مقايسة مراقبة جودة بروتين قيمة حيث أنه يوفر مستوى إضافية، حاسمة لتوصيف البروتين، مكملة لأساليب أخرى مثل مالس ثانية.
بينما مالس ثانية تقنية موحدة ومشتركة للتصميم الجماعي المولى البروتين، القرار منخفضة نسبيا من الأعمدة ثانية التحليلية المعيارية قد تحد من دقة القياسات الشامل المولى حققها مالس12. وتشمل بعض الأمثلة على القيود المفروضة على مالس ثانية الحلول التي تحتوي على التوالي ليغومرات، مستويات عالية من التجميع التي لا يفصلون تماما من ذروة مونومر، والسكان غير متجانسة مع الجماهير المولى مماثلة، مثل البروتينات المعدلة.
المستوى طريقة الفصل لوني أكثر تعقيداً تصميم وتنفيذ من ثانية، ولكن يمكن أن تكمل المعلومات المستقاة من تجربة مالس المستوى وأحيانا تكون مفيدة أكثر من تحليل مالس ثانية. مالس المستوى اتسم بنجاح جسم المتغيرات التي تشترك في نفس المولى، الشامل، ليغومرات التي لا يفصل تماما في ثانية والببتيدات القصيرة التي يصعب على تحليل ثانية12،24. أيضا، يمكن حل الجمعيات الجزيئات التي تكون كبيرة جداً تكون مفصولة ثانية، مثل جسيمات فارغة من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف)، والكامل (تحتوي على الحمض النووي الفيروسي) ب المستوى25 قبل التحليل مالس. مقارنة ثانية، المستوى يوفر قدرات أكثر تنوعاً في الفصل14 ، والمرونة في ضبط العديد من المعلمات لزيادة دقة الذروة، مثل درجة الحموضة العازلة، وأنواع الملح وأنواع وطول العمود، وغيرهم. خلافا ثانية، لا يوجد أي حد حجم لحقن العينة في المستوى، ويمكن تحليل أي جزيء مستقلة عن حجمه (انظر الجدول 1 في أمارتيلي et al.12). وهذا ميزة كبيرة من المستوى-مالس، أساسا لعينات بكثافة LS منخفضة، مثل البروتينات الصغيرة جداً أو البروتينات المخفف مع ميل للتجميع عند التركيز. منذ أعمدة المستوى التحليلي أكثر استقرارا وتميل إلى الإفراج عن الجسيمات أقل من ثانية الأعمدة، مالس المستوى يتطلب الموازنة قصيرة جداً من الوقت، واستقرت إشارات LS سريع جداً. وهذا يسمح لتشغيل التجارب الفردية كما هو موضح في هذا البروتوكول، ووقف تشغيل كما هو مطلوب.
خلافا للبورصة، الذي يوفر عادة نتائج جيدة مع واحد فقط تجربة (باستخدام عمود مع نطاق وجود الحق)، والمستوى قد يتطلب عدة تجارب لتحقيق الدقة المثلى بضبط معلمات الأسلوب. في المستوى-مالس التجارب التي تجري مع تدرج ملح، الموصلية المخزن المؤقت، ومن ثم تغيير ري هائلة أثناء التشغيل، مع ما يترتب عليه من تغييرات على إشارة ري. وهذا يتطلب فارغة إضافية تشغيل لكل تجربة مالس المستوى وتحليل مع الطرح خط الأساس (كما هو موضح في الخطوة 5، 2 من البروتوكول) إلا إذا كان تحليل تركيز محدود لكشف الأشعة فوق البنفسجية (التي تتطلب معرفة مسبقة الانقراض معاملات لكل ذروة). التحليل مع الطرح الأساس قوية للتدرجات الخطية، على الرغم من أن زيادة تطوير أسلوب ما زال لازما للطرح خط أساس نجاح برامج التدرجي الملح. وينبغي تعديل قيم dn/dc كل ذروة وفقا الموصلية المخزن المؤقت المحدد في ذروة التيد (العمليات الحسابية يمكن العثور عليها في الأدب12). إذا كان بروتين الوتيد بتركيز كلوريد الصوديوم أقل من 200 ملم (كما هو الحال في المثال جيش صرب البوسنة)، وهذا التعديل لا يكاد يذكر.
المهم كمية كبيرة نسبيا من البروتين المستخدمة في المستوى-مالس (كخطوة مفصلة في 2.3 من البروتوكول) مقارنة مالس ثانية من التغلب على تغيير جذري الإشارة ري بسبب التدرج الملح وتقلبات ري بسبب خلط ناقصة المخازن المؤقتة للتدرج. إذا تم استخدام كشف الأشعة فوق البنفسجية لقياس كتلة، فقط يمكن أن تستخدم كميات أصغر. كمية البروتين لحقن يعتمد على كتلة المولى للبروتين والتجانس والنقاء ومعامل الانقراض الأشعة فوق البنفسجية. ينبغي أن تكون الكتلة اللازمة وحقن أعلى بالنسبة للبروتينات أصغر حجماً وأقل بالنسبة للبروتينات الكبيرة (~ 1 ملغ كاتشين 20 مغ البروتين و ~0.2 لبروتين كاتشين 150). عينات متجانسة تتطلب الحقن بعينه أكثر حيث يتم تقسيم الكمية بين العديد من السكان. وقد تتطلب تحليلية عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) المواد أقل من نظام فبلك.
في الآونة الأخيرة، أبلغ عن التحليل في خط باستخدام مالس أثناء إجراءات التطهير. مثل هذا تحليل في الوقت الحقيقي فعالة جداً للكشف عن منتجات التجميع التي تحدث أثناء تنقية ويمكن الاستغناء عن أي تحليل المزيد من البروتين بعد تنقية26. المستوى اللوني يستخدم بشكل متكرر كخطوة وسيطة تنقية؛ وهكذا، يمكن أن يكون تركيبة الأعمدة المستوى محضرة مع مالس مفيدة ليس فقط كأسلوب وصف تحليلي ولكن أيضا كإجراء تحليل في الوقت الحقيقي لإجراءات تطهير واسعة النطاق. نوناناليتيكال المستوى الأعمدة هي أيضا مستقرة، مع درجة منخفضة من الإفراج عن الجسيمات، وذلك، يمكن استخدامها مع مالس. تقنيات فصل أخرى، مثل التقارب اللوني أو تبادل مسعور اللوني، كما يمكن أن يقترن مالس عندما تعرض لعينات نقية نسبيا (لتفادي تلوث كاشفات مالس ومنظمة الروتاري الدولية). وهذا يتطلب تكييف وإشارات الأمثل لطريقة الحصول على ليس فقط فصل الذروة جيدة لكن LS نظيفة بما فيه الكفاية أيضا ومنظمة الروتاري الدولية لتحليل مالس ناجحة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور صافي Danieli (مركز وولفسون “تطبيق علم الأحياء الهيكلية”، الجامعة العبرية) للمشورة والتعاون. كما يشكر المؤلفون Danyel للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (رحوفوت، إسرائيل) لتقديم المساعدة، وإنشاء نظام فبلك مالس التحليلية المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
| 0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
| BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
| miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
| mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
| Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
| 0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
| Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
| TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |
References
- Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
- Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
- Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
- Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
- Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
- Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
- Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
- Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
- Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
- Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -. L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
- Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
- Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
- Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
- Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
- Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
- Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
- Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
- Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
- Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
- Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).
