Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi
Summary
Burada, non-invaziv ve detay odaklı bir şekilde Drosophila embriyolarında embriyonik kas kasılmaları kaydetmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Eşgüdümlü kas kasılmaları, Drosophila embriyolarında gelişme sırasında erken görülen ritmik davranışların bir biçimidir. Neuronal duyusal geri besleme devreleri bu davranışı kontrol etmek için gereklidir. Kasılmalar ritmik deseni üretmek için başarısızlık nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir. Daha önce protein o-mannosylation kusurları, bir posttranslasyonel protein modifikasyon, duyusal nöronların Akon morfolojisi etkileyen ve embriyolar anormal koordine kas kasılmaları sonucu bulundu. Burada, biz protein kas kasılma fenotipi karakterize etmek için kullanılan hatching noktasına kadar geç evre embriyo canlı görüntüleme tarafından peristaltik kas kasılmaları desen kayıt ve analiz için nispeten basit bir yöntem sunuyoruz O-mannosyliltransferase mutantlar. Bu kayıtlardan elde edilen veriler, farklı vücut segmentlerinde kas kasılmasının frekans, yayılma yönü ve bağıl amplitül gibi kas kasılma dalgalarını analiz etmek için kullanılabilir. Biz de vücut duruş incelenmiştir ve doğru embriyo orta çizgi konumunu belirlemek için kaslar özellikle ifade edilen bir floresan işaretçinin avantajlarından alınmıştır. Benzer bir yaklaşım da embriyo haddeleme ve hatching gibi geliştirme sırasında çeşitli davranışları incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Peristaltik kas kasılma, insanlar1,2,3yürüyüş ve yüzme benzer bir ritmik motor davranışıdır. Drosophila geç evre embriyolar görülen embryonik kas kasılmaları böyle bir davranış örneği temsil eder. Drosophila çeşitli gelişimsel süreçleri incelemek için mükemmel bir model organizmadır, çünkü Drosophila ‘da embriyonik gelişim iyi karakterize edilir, nispeten kısa ve izlenmesi kolay. Bizim yöntemin genel amacı dikkatle kaydetmek ve kasılma ve embriyonik kasların rahatlama dalga boyunu desen analiz etmektir. Biz ayrıntılı bir görselleştirme, kayıt ve kas kasılmaları analizi sunan basit, non-invaziv bir yaklaşım kullandık. Bu yöntem de potansiyel olarak diğer in vivo süreçleri incelemek için kullanılabilir, gibi embriyonik Rolling geç evre embriyolar sadece önce tarlama öncesinde görülen. Önceki çalışmalarda, embriyonik kas kasılmaları çoğunlukla frekans ve yön1,2açısından analiz edildi. Anterior veya posterior yönde vücut ekseni boyunca ilerleme olarak kasılmalar bağıl kapsamını tahmin etmek için, biz kas özellikle GFP ifade embriyoları kullandık. Bu analiz, kas kasılmaları analiz etmek ve kas kasılmaları peristaltik dalgalar serisi sırasında embriyolar vücut duruş nasıl sürdürülür ortaya çıkarmak için daha nicel bir yol sağlar.
Peristaltik kas kasılmaları merkezi desen jeneratör (CPG) devreler ve periferik sinir sistemi (PNS), merkezi sinir sistemi (CNS) ve kaslar4,5nöronlar arasında iletişim tarafından kontrol edilir. Normal peristaltik kas kasılmaları üretmek için başarısızlık,2 ve anormal larva lokomolojik6 ve nörolojik anomalilerin göstergesi olabilir kaçak gibi kusurları neden olabilir. Kas kasılma ve kasılma fenotiplerinin detaylı analizi peristaltik dalgaların canlı görüntüleme, lokomotif dahil kaslar ve nöral devreleri etkileyen genetik kusurları ile ilişkili patojen mekanizmaları ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Son zamanlarda bu yaklaşım, pRotein O–mannosyltransferaz (pomt) mutantlar7bir vücut duruş torsiyon fenotürü neden mekanizmaları araştırmak için kullandık.
Protein O-mannosylation (POM) posttranslasyonel modifikasyon özel bir türüdür, bir mannoz şeker serin eklenir ya da salgı yolu proteinleri treonin kalıntıları8,9. Genetik kusurları POM neden konjenital kas distrophies (CMD) insanlarda10,11,12. Bu hastalıkların etken mekanizmalarını model sistemi olarak Drosophila kullanarak araştırdık. Biz Drosophila protein O-mannosyltransferase genler POMT1 ve POMT2 (aka Döndürülmüş karın (RT) ve bükülmüş (tw)) içinde mutasyonlar ile embriyo bulundu bir anormal vücut duruş sonuçları vücut segmentleri, deplasman (“dönme”)7. İlginçtir ki, bu kusur, peristaltik kas kasılmaları belirgin hale geldiğinde gelişimsel aşamasına denk gelmiştir7.
Kaslı ve epidermis zaten oluşmuş ve koordine kas kasılmaları peristaltik dalgalar başladı POM mutant embriyolar anormal vücut duruş doğar beri, biz anormal vücut duruş anormal kas bir sonucu olabilir hipotez kas veya/ve epidermis morfoloji bir kusur yerine kasılmalar7. CMDS anormal kas kasılmaları ve duruş kusurları ile ilişkili olabilir13, ve böylece Drosophila pomt mutantlarda duruş fenotipi Analizi kas distrophies ile ilişkili patolojik mekanizmaları aydınlatmak olabilir . Drosophila pomt mutantların vücut duruş fenotipi ve kas kasılmaları peristaltik dalgalar olası anomaliler arasındaki ilişkiyi incelemek için, biz canlı kullanarak detaylı kas kasılmaları analiz karar verdi görüntüleme yaklaşımı.
Drosophila embriyolarında peristaltik kasılma dalgaları analizimiz, tip 1 ve tip 2 dalgaları olarak belirlenmiş iki farklı kasılma modu ortaya koydu. Tip 1 dalgalar anterior posterior veya tersi yayılan basit dalgalar vardır. Tip 2 dalgalar anterior ucunda Başlatan bifazik dalgalar, posterior yönde yarım yaymak, anlık durağan, bir temporal statik kasılma şekillendirme, ve daha sonra, ikinci aşamada, yayar bir peristaltik kasılma tarafından süpürülür arka ucunda ileri. Vahşi tip embriyolar normalde yaklaşık 75% tip 1 ve% 25 tip 2 dalgadan oluşan bir dizi kasılmalar üretir. Buna karşılık, Pomt mutant embriyo türü 1 ve tip 2 dalgalar yaklaşık eşit göreli Frekanslar oluşturur.
Yaklaşımımız kas kasılmaları ve embriyo haddeleme7nicel analizi için ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Bu yaklaşım, kas kasılmaları içeren diğer davranışların analizine de uyarlanabilir, örneğin tarama ve tarama gibi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yöntemimiz, dalga periodicity, genlik ve desen gibi peristaltik kas kasılma dalgaları, embriyo haddeleme ve duruş üzerinde dalga etkisi gibi gelişim sırasında önemli embriyo davranışlarını analiz etmek için nicel bir yol sağlar. Bu, embriyonik gelişim sırasında bu ve diğer davranışları düzenleyen belirli genlerin rolünü incelemek için farklı mutantların analizinde yararlı olabilir. Biz kas kasılma genliği, frekans ve embriyoların kasılma dalgası yayılma yönünü analiz etmek için kasl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje kısmen sağlık hibe RO1 NS099409, NS075534 ve CONACYT 2012-037 (S) VP için ulusal enstitüler tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
