הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להקליט התכווצויות שרירים עובריים בעוברי דרוזוהילה בצורה לא פולשנית ומונחה פרטים.
Abstract
התכווצויות שרירים מתואמת הם צורה של התנהגות קצבית לראות מוקדם במהלך הפיתוח של העוברים דרוסופילה . מעגלי משוב חושי סנסוריים נדרשים לשלוט באופן פעולה זה. אי הפקת דפוס קצבי של התכווצויות יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. בעבר גילינו כי פגמים בחלבון O-mannosyזילציה, שינוי חלבון posttranslational, להשפיע על מורפולוגיה אקסון של נוירונים חושים ולגרום התכווצויות שרירים מתואמת נורמלי עוברים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה יחסית להקלטה וניתוח התבנית של התכווצויות שרירים הפריסטלטיות על ידי הדמיה חיה של עוברי שלב מאוחר עד לנקודת הבקיעה, אשר השתמשנו כדי לאפיין את התכווצות שרירים מרשם של חלבון . או-מנסילאז מוטציות נתונים שהתקבלו מהקלטות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח גלי התכווצות שרירים, כולל תדירות, כיוון התפשטות ומשרעת יחסי של התכווצויות שרירים בחלקי גוף שונים. בדקנו גם את תנוחת הגוף ואת היתרון של סמן פלורסנט הביע במיוחד השרירים כדי לקבוע במדויק את מיקומו של העובר באמצע הקו. גישה דומה יכולה להיות מנוצל גם לחקר התנהגויות שונות במהלך הפיתוח, כגון העובר מתגלגל והבקיעה.
Introduction
התכווצות שרירים פריסטלטית היא התנהגות מוטורית קצבית דומה הליכה ושחייה בבני אדם1,2,3. התכווצויות שרירים עובריים לראות Drosophila ילה עוברים בשלב מאוחר מייצגים דוגמה של התנהגות כזאת. דרוזופילה היא אורגניזם מודל מצוין לחקר תהליכים התפתחותיים שונים, משום שפיתוח עובריים בדרוסופילה מאופיין היטב, קצר יחסית, וקל לניטור. המטרה הכוללת של השיטה שלנו היא להקליט בקפידה ולנתח את דפוס ההתכווצות של התכווצות והרפיה של השרירים העובריים. השתמשנו בגישה פשוטה, לא פולשנית המציעה הדמיה מפורטת, הקלטה וניתוח של התכווצויות שרירים. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד אחרים בתהליכים vivo, כגון מתגלגל עובריים לראות העוברים בשלב מאוחר רק לפני הבקיעה. במחקרים קודמים, התכווצויות שרירים עובריים נותחו בעיקר במונחים של תדר וכיוון1,2. על מנת לאמוד את היקף יחסי של הצירים כפי שהם התקדמות לאורך ציר הגוף בכיוון הקדמי או האחורי, השתמשנו העוברים ביטוי GFP במיוחד השרירים. ניתוח זה מספק דרך כמותית יותר לנתח התכווצויות שרירים כדי לחשוף כיצד תנוחת הגוף העוברים נשמרת במהלך סדרה של גלי הפריסטטיים של התכווצויות שרירים.
התכווצויות שרירים פריסטלטיות נשלטות על ידי מחולל תבנית מרכזית (CPG) מעגלים ותקשורת בין נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (היקפית), מערכת העצבים המרכזית (cn), והשרירים4,5. אי הפקת התכווצויות שרירים נורמלית הפריסטלטית יכול להוביל לפגמים כגון כישלון בצוהר2 ו זחל נורמלי תנועה6 והוא יכול להיות מעיד על חריגות נוירולוגיות. הדמיה חיה של גלים הפריסטטיים של התכווצות שרירים וניתוח מפורט של פנוטיפים התכווצות יכול לעזור לחשוף מנגנונים פתוגניים הקשורים פגמים גנטיים המשפיעים על השרירים ומעגלים עצביים מעורב תנועה. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כדי לחקור מנגנונים כי התוצאה של פיתול יציבה הגוף פנוטיפ של pפרוטאין O–mannosyltבראנפראז (pomt) מוטציות7.
החלבון O-mannosylation (פום) הוא סוג מיוחד של שינוי פוסט-ממדי, שם מתווסף הסוכר סרין או שאריות של חלבונים של מסלול הפרשה8,9. פגמים גנטיים ב פום לגרום dystrophies שרירים מולדים (CMD) בבני אדם10,11,12. בדקנו את המנגנונים הסיבתי של מחלות אלו באמצעות דרוסופילה כמערכת מודל. מצאנו כי עוברים עם מוטציות ב Drosophila ילה חלבון O-mannosyltransferase גנים POMT1 ו POMT2 (הידוע הבטן מסובב (rt) ו מעוות (tw)) להראות מ עקירה (“סיבוב”) של חלקי הגוף, אשר התוצאה היא יציבה גוף7. מעניין, פגם זה בד בבד עם השלב ההתפתחותי כאשר התכווצויות שרירים הפריסטלטיות להיות בולטות7.
מאז יציבה גוף חריג העוברים מוטציה פום מתעוררת כאשר השרירים והאפידרמיס הם כבר הקימו וגלים הפריסטלטיים של התכווצויות שרירים מתואמת החלו, שיערו כי יציבה הגוף לא נורמלי יכול להיות תוצאה של שריר נורמלי התכווצויות במקום פגם שריר או/ו אפידרמיס מורפולוגיה7. CMDs יכול להיות משויך עם התכווצויות שרירים חריגים ופגמים יציבה13, ובכך ניתוח של התנוחה פנוטיפ ב- drosophila pomt מוטציות עשוי להבהיר מנגנונים פתולוגיים הקשורים dystrophies שרירי . על מנת לחקור את היחסים בין הגוף הפנוטיפ של מוטציות מוטנטים וליקויים אפשריים בגלים הפריסטטיים של התכווצויות שרירים, החלטנו לנתח התכווצויות שרירים בפירוט באמצעות לחיות גישת הדמיה.
הניתוח שלנו של גלי התכווצות הפריסטטיות בעוברים הדרוזופילה חשף שני מצבי התכווצות נפרדים, המיועדים כסוג 1 ומסוג 2 גלים. מסוג 1 גלים הם גלים פשוטים הפצת מן הקדמי לאחורי או להיפך. הגלים מסוג 2 הם גלים ביפאטיים היוזמים בקצה הקדמי, מופצים באמצע הדרך בכיוון האחורי, מסתיימים לרגע, יוצרים כיווץ סטטי זמני, ולאחר מכן, במהלך השלב השני, הם נסחפים באמצעות כיווץ פריסטי המחפיץ . קדימה מהקצה האחורי פראי טיפוס העוברים בדרך כלל ליצור סדרה של התכווצויות המורכבת של כ 75% סוג 1 ו -25% סוג 2 גלים. לעומת זאת, עוברי מוטציה של Pomt ליצור סוג 1 ו 2 גלים בערך שוויון תדרים יחסית.
הגישה שלנו יכול לספק מידע מפורט לניתוח כמותי של התכווצויות שרירים העובר מתגלגל7. גישה זו יכול גם להיות מותאם לניתוח של התנהגויות אחרות הקשורות התכווצויות שרירים, כגון בקיעה וזחילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה שלנו מספקת דרך כמותית לנתח התנהגויות העובר חשוב במהלך הפיתוח, כגון גלי השריר הפריסטטי התכווצות, כולל גל תקופתיות, משרעת ודפוס, כמו גם אפקט גל על העובר מתגלגל ויציבה. זה יכול להיות שימושי ניתוחים של מוטציות שונות כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים בוויסות אלה והתנהגויות אחרות במהלך …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט היה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות RO1 NS099409, NS075534, ו CONACYT 2012-037 (S) לסמנכ ל.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
