Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila
Summary
Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les contractions musculaires embryonnaires dans les embryons de Drosophila d’une manière non-invasive et axée sur les détails.
Abstract
Les contractions musculaires coordonnées sont une forme de comportement rythmique observée tôt au cours du développement chez les embryons de Drosophila. Des circuits de rétroaction sensorielle neuronale sont nécessaires pour contrôler ce comportement. L’échec de produire le modèle rythmique des contractions peut être indicatif des anomalies neurologiques. Nous avons précédemment constaté que les défauts dans la protéine O-mannosylation, une modification post-translationnelle de protéine, affectent la morphologie d’axone des neurones sensoriels et ont comme conséquence des contractions coordonnées anormales de muscle dans des embryons. Ici, nous présentons une méthode relativement simple pour enregistrer et analyser le modèle des contractions de muscle péristaltique par l’imagerie en direct des embryons de stade tardif jusqu’au point de l’éclosion, que nous avons employé pour caractériser le phénotype de contraction de muscle de protéine O-mannosyltransferase mutants. Les données obtenues à partir de ces enregistrements peuvent être utilisées pour analyser les ondes de contraction musculaire, y compris la fréquence, la direction de la propagation et l’amplitude relative des contractions musculaires à différents segments du corps. Nous avons également examiné la posture du corps et profité d’un marqueur fluorescent exprimé spécifiquement dans les muscles pour déterminer avec précision la position de la ligne médiane de l’embryon. Une approche similaire peut également être utilisée pour étudier divers autres comportements au cours du développement, tels que le roulement et l’éclosion d’embryons.
Introduction
La contraction du muscle péristaltique est un comportement moteur rythmique similaire à la marche et la natation chez l’homme1,2,3. Les contractions musculaires embryonnaires observées chez les embryons de phase tardive de Drosophila représentent un exemple d’un tel comportement. Drosophila est un excellent organisme modèle pour étudier divers processus de développement parce que le développement embryonnaire dans Drosophila est bien caractérisé, relativement court, et facile à surveiller. L’objectif global de notre méthode est d’enregistrer soigneusement et d’analyser le modèle onduleux de contraction et de relaxation des muscles embryonnaires. Nous avons utilisé une approche simple et non invasive qui offre une visualisation détaillée, l’enregistrement et l’analyse des contractions musculaires. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier d’autres processus in vivo, tels que le roulement embryonnaire observé chez les embryons à un stade avancé juste avant l’éclosion. Dans des études antérieures, les contractions musculaires embryonnaires ont été principalement analysées en termes de fréquence et de direction1,2. Afin d’estimer l’étendue relative des contractions au fur et à mesure qu’elles progressent le long de l’axe du corps dans la direction antérieure ou postérieure, nous avons utilisé des embryons exprimant le GFP spécifiquement dans les muscles. Cette analyse fournit un moyen plus quantitatif d’analyser les contractions musculaires et de révéler comment la posture du corps chez les embryons est maintenue pendant une série d’ondes péristétiques de contractions musculaires.
Les contractions musculaires péristaltiques sont contrôlées par des circuits de générateurs centraux (CPG) et des communications entre les neurones du système nerveux périphérique (PNS), le système nerveux central (SNC) et les muscles4,5. L’échec de produire des contractions peristaltiques normales de muscle peut mener aux défauts tels que l’échec à éclore2 et à la locomotion larvaire anormale6 et peut être indicatif des anomalies neurologiques. La formation image vivante des ondes péristaltiques de contraction musculaire et l’analyse détaillée des phénotypes de contraction peuvent aider à découvrir les mécanismes pathogènes associés aux défauts génétiques affectant les muscles et les circuits neuronaux impliqués dans la locomotion. Nous avons récemment utilisé cette approche pour étudier les mécanismes qui se traduisent par un phénotype de torsion de posture du corps de protein O–mannosyltransferase (POMT) mutants7.
Protein O-mannosylation (POM) est un type spécial de modification post-traductionnelle, où un sucre mannose est ajouté à la sérine ou des résidus de thréonine de protéines de voie sécrétrice8,9. Les défauts génétiques dans LES POM causent des dystrophies musculaires congénitales (CMD) chez l’homme10,11,12. Nous avons étudié les mécanismes causatifs de ces maladies en utilisant drosophila comme système modèle. Nous avons constaté que les embryons avec des mutations dans la protéine Drosophila O-mannosyltransferase gènes POMT1 et POMT2 (alias l’abdomen rotatif (rt) et tordu (tw)) montrent un («rotation») des segments du corps, ce qui entraîne une posture corporelle anormale7. Intéressant, ce défaut a coïncidé avec le stadedéveloppemental quand les contractions de muscle péristaltic deviennent proéminentes 7.
Puisque la posture anormale de corps dans les embryons mutants de POM se produit quand la musculature et l’épiderme sont déjà formés et les ondes péristaltiques des contractions musculaires coordonnées ont commencé, nous avons supposé que la posture anormale de corps pourrait être une conséquence du muscle anormal contractions plutôt qu’un défaut dans la morphologie musculaire ou/et épiderme7. CMDs peuvent être associés à des contractions musculaires anormales et des défauts de posture13, et donc l’analyse du phénotype de posture dans les mutants Drosophila POMT peut élucider les mécanismes pathologiques associés aux dystrophies musculaires . Afin d’étudier la relation entre le phénotype de posture de corps des mutants de POMT de Drosophila et les anomalies possibles dans les ondes péristaltiques des contractions de muscle, nous avons décidé d’analyser des contractions de muscle en détail utilisant un vivant approche d’imagerie.
Notre analyse des ondes de contraction péristétiques chez les embryons de Drosophila a révélé deux modes de contraction distincts, désignés comme ondes de type 1 et de type 2. Les ondes de type 1 sont de simples ondes qui se propagent de l’antérieur au postérieur ou vice versa. Les ondes de type 2 sont des ondes biphasiques qui s’initient à l’extrémité antérieure, se propagent à mi-chemin dans la direction postérieure, s’arrêtent momentanément, formant une contraction statique temporelle, puis, au cours de la deuxième phase, sont balayées par une contraction péristique qui se propage en avant de l’extrémité postérieure. Les embryons de type sauvage génèrent normalement une série de contractions qui se compose d’environ 75 % d’ondes de type 1 et de 25 % de type 2. En revanche, les embryons mutants POMT génèrent des ondes de type 1 et de type 2 à des fréquences relatives à peu près égales.
Notre approche peut fournir des informations détaillées pour l’analyse quantitative des contractions musculaires et du roulement des embryons7. Cette approche pourrait également être adaptée pour l’analyse d’autres comportements impliquant des contractions musculaires, telles que l’éclosion et l’exploration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre méthode fournit un moyen quantitatif d’analyser les comportements embryonnaires importants au cours du développement, tels que les ondes de contraction des muscles péristaltiques, y compris la périodicité des ondes, l’amplitude et le modèle, ainsi que l’effet des ondes sur le roulement et la posture des embryons. Cela peut être utile dans l’analyse de différents mutants pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans la régulation de ces comportements et d’autres au cours du développement embryonnaire….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet a été soutenu en partie par les National Institutes of Health Grants RO1 NS099409, NS075534, et CONACYT 2012-037(S) au vice-président.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
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