التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا
Summary
هنا، نقدم طريقة لتسجيل تقلصات العضلات الجنينية في أجنة دروسوفيلا بطريقة غير الغازية والموجهة نحو التفاصيل.
Abstract
تقلصات العضلات المنسقة هي شكل من أشكال السلوك الإيقاعي ينظر في وقت مبكر أثناء التنمية في أجنة دروسوفيلا. مطلوب دوائر التغذية المرتدة الحسية العصبية للسيطرة على هذا السلوك. الفشل في إنتاج النمط الإيقاعي من تقلصات يمكن أن يكون مؤشرا على تشوهات عصبية. وجدنا سابقا أن العيوب في البروتين O-mannosylation، تعديل البروتين ما بعد الترجمة، تؤثر على مورفولوجيا محور الخلايا العصبية الحسية وتؤدي إلى تقلصات العضلات المنسقة غير طبيعية في الأجنة. هنا، نقدم طريقة بسيطة نسبيا لتسجيل وتحليل نمط تقلصات العضلات التمعجية عن طريق التصوير الحي للأجنة المرحلة المتأخرة حتى نقطة الفقس، والتي كنا تميز النمط الظاهري للتقلص العضلي للبروتين مسوخ المنوسيلترانساز ويمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التسجيلات لتحليل موجات تقلص العضلات، بما في ذلك التردد، واتجاه الانتشار والسعة النسبية لتقلصات العضلات في أجزاء الجسم المختلفة. كما قمنا بفحص وضع الجسم واستفادتنا من علامة الفلورسنت التي تم التعبير عنها على وجه التحديد في العضلات لتحديد بدقة موقف خط الوسط الجنيني. ويمكن أيضا استخدام نهج مماثل لدراسة مختلف السلوكيات الأخرى أثناء النمو، مثل المتداول الجنين والفقس.
Introduction
تقلص العضلات التمعجي هو سلوك حركي إيقاعي مشابه للمشي والسباحة في البشر1و2و3. إن تقلصات العضلات الجنينية التي شوهدت في أجنة دروسوفيلا في مرحلة متأخرة تمثل مثالاً على مثل هذا السلوك. Drosophila هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة مختلف العمليات التنموية لأن النمو الجنيني في دروسوفيلا يتميز بشكل جيد، قصيرة نسبيا، وسهلة الرصد. الهدف العام لأسلوبنا هو تسجيل وتحليل نمط الموجي من الانكماش والاسترخاء من العضلات الجنينية بعناية. استخدمنا نهجا ً بسيطاً وغير غازي يقدم تصوراً مفصلاً وتسجيلاً وتحليلاً لتقلصات العضلات. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة عمليات أخرى في الجسم الحي، مثل المتداول الجنيني ينظر في الأجنة في مرحلة متأخرة فقط قبل الفقس. في الدراسات السابقة، تم تحليل تقلصات العضلات الجنينية في الغالب من حيث التردد والاتجاه1،2. من أجل تقدير المدى النسبي للتقلصات لأنها تتقدم على طول محور الجسم في الاتجاه الأمامي أو الخلفي، استخدمنا الأجنة التي تعبر عن GFP على وجه التحديد في العضلات. يوفر هذا التحليل طريقة كمية أكثر لتحليل تقلصات العضلات والكشف عن كيفية الحفاظ على وضع الجسم في الأجنة خلال سلسلة من الموجات التمعجية من تقلصات العضلات.
يتم التحكم في تقلصات العضلات التمعجية بواسطة الدوائر مولد نمط مركزي (CPG) والاتصالات بين الخلايا العصبية للجهاز العصبي المحيطي (PNS)، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، والعضلات4،5. الفشل في إنتاج تقلصات العضلات التمعجية الطبيعية يمكن أن يؤدي إلى عيوب مثل الفشل في فقس2 وحركة اليرقات غير طبيعية6 ويمكن أن يكون مؤشرا على تشوهات عصبية. التصوير الحي للموجات التمعجية من تقلص العضلات والتحليل المفصل للأنماط الظاهرية الانكماش يمكن أن تساعد في الكشف عن الآليات المسببة للأمراض المرتبطة بالعيوب الوراثية التي تؤثر على العضلات والدوائر العصبية المشاركة في الحركة. استخدمنا مؤخرا هذا النهج للتحقيق في الآليات التي تؤدي إلى وضع الجسم التواء النمط الظاهري من Protein O–mannosyltransferase (POMT) المسوخ7.
البروتين O-mannosylation (POM) هو نوع خاص من تعديل ما بعد الترجمة، حيث يتم إضافة السكر مانوز إلى بقايا سيرين أو ثروينين من البروتينات المسار إفرازي8،9. العيوب الوراثية في POM تسبب خلل العضلات الخلقية (CMD) في البشر10،11،12. لقد بحثنا في الآليات المسببة لهذه الأمراض باستخدام دروسوفيلا كنظام نموذجي. وجدنا أن الأجنة مع الطفرات في بروتين دروسوفيلا O-mannosyltransferase الجينات POMT1 وPOMT2 (المعروف أيضا باسم البطن المتناوب (RT) والملتوية (TW)) تظهر الإزاحة (“دوران”) من أجزاء الجسم، مما يؤدي إلى وضع الجسم غير طبيعي7. ومن المثير للاهتمام، تزامن هذا العيب مع مرحلة النمو عندما تصبح تقلصات العضلات التمعجية بارزة7.
منذ وضع الجسم غير طبيعي في الأجنة متحولة POM تنشأ عندما يتم تشكيل العضلات والبشرة بالفعل وبدأت موجات التمعجية من تقلصات العضلات المنسقة، افترضنا أن وضع الجسم غير طبيعي يمكن أن يكون نتيجة لعضلة غير طبيعية تقلصات بدلا من عيب في العضلات و / ومورفولوجيا البشرة7. CMDs يمكن أن ترتبط مع تقلصات العضلات غير طبيعية وعيوب الموقف13، وبالتالي فإن تحليل النمط الظاهري الموقف في مسوخ Drosophila POMT قد توضح الآليات المرضية المرتبطة بخلل العضلات . من أجل التحقيق في العلاقة بين النمط الظاهري موقف الجسم من المسوخ Drosophila POMT والتشوهات المحتملة في موجات التمعجيمن من تقلصات العضلات، قررنا تحليل تقلصات العضلات بالتفصيل باستخدام العيش نهج التصوير.
كشف تحليلنا لموجات الانكماش التمعجي في أجنة دروسوفيلا عن وضعين منفصلين للإنقباض، تم تعيينهما كموجات من النوع 1 والنوع 2. موجات النوع 1 هي موجات بسيطة تُنشر من الأمامي إلى الخلفي أو العكس بالعكس. موجات من النوع 2 هي موجات biphasic التي تبدأ في الطرف الأمامي، تنتشر في منتصف الطريق في الاتجاه الخلفي، ووقف لحظة، وتشكيل انكماش ثابت زمني، وبعد ذلك، خلال المرحلة الثانية، اجتاحت من قبل تقلص التمعجي الذي ينتشر إلى الأمام من النهاية الخلفية. تولد الأجنة البرية عادة سلسلة من الانقباضات التي تتكون من حوالي 75٪ من النوع 1 و 25٪ من النوع 2 موجات. وعلى النقيض من ذلك، تولد الأجنة المتحولة من نوع POMT موجات من النوع 1 والنوع 2 بترددات نسبية متساوية تقريباً.
نهجنا يمكن أن توفر معلومات مفصلة للتحليلالكمي لتقلصات العضلات والجنين المتداول 7. ويمكن أيضا تكييف هذا النهج لتحليل السلوكيات الأخرى التي تنطوي على تقلصات العضلات, مثل الفقس والزحف.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر طريقتنا طريقة كمية لتحليل سلوكيات الأجنة الهامة أثناء النمو، مثل موجات تقلص العضلات التمعجية، بما في ذلك دورية الموجة، والسعة والنمط، فضلا عن تأثير الموجة على لف الأجنة والموقف. وهذا يمكن أن يكون مفيدا في تحليلات المتحولين المختلفة لدراسة دور جينات محددة في تنظيم هذه السلوكيات وغير…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم المشروع جزئيامن المعاهد الوطنية للمنح الصحية RO1 NS099409، NS075534، وCONACYT 2012-037 (S) إلى نائب الرئيس.
Materials
| Digital camera | Hamamatsu CMOS ORCA-Flash 4.0 | C13440-20CU | With different emission filters |
| Forceps | FST Dumont | 11254-20 | Tip Dimensions 0.05 mm x 0.01 mm |
| LED | X-cite BDX (Excelitas) | XLED1 | |
| Microscope | Carl Ziess Examiner D1 | 491405-0005-000 | Epiflourescence with time lapse |
| Needle | BD | 305767 | 25 G x 1-1/2 in |
| Paintbrush | Contemporary crafts | Any paintbrush will work | |
| Petri dishes | VWR | 25384-164 | 60 mm x 15 mm |
| Software | HCImage Live | ||
| Thread Zap Wax pen | Thread Zap II (by BeadSmith)(Amazon) | TZ1300 | Burner Tool |
| Tricorner plastic beaker | VWR | 25384-152 | 100 mL |
References
- Pereanu, W., Spindler, S., Im, E., Buu, N., Hartenstein, V. The emergence of patterned movement during late embryogenesis of Drosophila. Developmental Neurobiology. 67, 1669-1685 (2007).
- Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
- Crisp, S., Evers, J. F., Fiala, A., Bate, M. The development of motor coordination in Drosophila embryos. Development. 135, 3707-3717 (2008).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America. 104, 5199-5204 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Molecular and Cellular Neuroscience. 35, 383-396 (2007).
- Gorczyca, D. A., et al. Identification of Ppk26, a DEG/ENaC channel functioning with Ppk1 in a mutually dependent manner to guide locomotion behavior in Drosophila. Cell Reports. 9, 1446-1458 (2014).
- Baker, R., Nakamura, N., Chandel, I., et al. Protein O-Mannosyltransferases affect sensory axon wiring and dynamic chirality of body posture in the Drosophila embryo. Journal of Neuroscience. 38 (7), 1850-1865 (2018).
- Nakamura, N., Lyalin, D., Panin, V. M. Protein O-mannosylation in animal development and physiology: From human Disorders to Drosophila phenotypes. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21, 622-630 (2010).
- Lyalin, D., et al. The twisted gene encodes Drosophila protein O-mannosyltransferase 2 and genetically interacts with the rotated abdomen gene encoding Drosophila protein O-mannosyltransferase 1. Genetics. 172, 343-353 (2006).
- Beltrán-Valero de Bernabe, D., et al. Mutations in the O-Mannosyltransferase gene POMT1 give rise to the severe neuronal migration disorder Walker-Warburg Syndrome. American Journal of Human Genetics. 71, 1033-1043 (2002).
- Reeuwijk, J., et al. POMT2 mutations cause alpha-dystroglycan hypoglycosylation and Walker-Warburg syndrome. Journal of Medical Genetics. 42, 907-912 (2005).
- Jaeken, J., Matthijs, G. Congenital disorders of glycosylation: A rapidly expanding disease family. Annual Reviews of Genomics and Human Genetics. 8, 261-278 (2007).
- Leyten, Q. H., Gabreels, F. J., Renier, W. O., ter Laak, H. J. Congenital muscular dystrophy: a review of the literature. Clinical and Neurological Neurosurgery. 98 (4), 267-280 (1996).
- Roberts, D. B., Hames, B. D. Drosophila: A Practical Approach. 2nd ed. The Practical Approach Series. , 389 (1998).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped+ interneurons are core components of a sensorimotor circuit that maintains left-right symmetric muscle contraction amplitude. Neuron. 88, 314-329 (2015).
- Penjweini, R., et al. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: a new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. J. Microscopy. 245, 100-108 (2011).
