Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme
Summary
Yeni, immünostasyon uyumlu doku Temizleme teknikleri gibi solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme kuduz virüsü beyin enfeksiyonu ve karmaşık hücresel çevre 3D görselleştirme sağlar. Kalın, antikor etiketli beyin dokusu dilimleri, görüntüleme derinliğini artırmak ve konfetik lazer tarama mikroskobu ile 3D analizini sağlamak için optik olarak şeffaf hale gelmiştir.
Abstract
Enfeksiyon süreçlerinin doku ve organlarda immunolabeling tarafından görselleştirilmesi, modern enfeksiyon biyolojisinde önemli bir yöntemdir. Organ dokularının içindeki dağıtım, tropizm ve patojenlerin zenginliğini gözlemlemek ve incelemek yeteneği, hastalık gelişimi ve ilerlemesi hakkında önemli veriler sağlar. Konvansiyonel mikroskopi yöntemlerini kullanarak immünolabeling çoğunlukla parafin-katıştırılmış veya dondurulmuş örneklerden elde edilen ince bölümlerle sınırlıdır. Ancak, bu ince bölümlerin sınırlı 2D görüntü düzlemi, virüslü bir organın karmaşık yapısı ve enfeksiyonun hücresel bağlamında önemli bilgi kaybına yol açabilir. Modern çok renkli, immünostatif uyumlu doku Temizleme teknikleri şimdi virüs enfekte organ dokusu yüksek hacimli 3D görüntü yığınları incelemek için nispeten hızlı ve ucuz bir yol sağlar. Dokuyu organik çözücülere maruz bırakarak optik olarak şeffaflaşır. Bu, numunenin refraktif endeksler ile eşleşir ve sonunda ışık saçılma önemli bir azalma yol açar. Böylece, uzun serbest çalışma mesafesi hedefleri ile birlikte, yüksek çözünürlükte geleneksel Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile boyutu 1 mm ‘ye kadar büyük doku bölümleri görüntülenmiş olabilir. Burada, virüs patogenezi, Spread, tropizm ve nöroinvazyon gibi konuları incelemek amacıyla enfekte beyinlerde kuduz virüsü dağıtımını görselleştirmek için doku temizledikten sonra derin doku görüntülemenin uygulanması için bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Konvansiyonel Histoloji teknikleri çoğunlukla karmaşık bir 3D ortama sadece 2D Öngörüler sağlayabilen organ dokularının ince bölümlerine güveniyor. Prensip olarak uygulanabilir olsa da, seri ince bölümlerden 3D yeniden yapılanma hem Dilimleme ve elde edilen görüntülerin silico hizalama sonraki için teknik boru hatları talep gerektirir1. Ayrıca, mikrotome Dilimleme işleminden sonra z-hacimlerin kesintisiz yeniden oluşturulması, hem mekanik hem de Hesaplamalı eserler nedeniyle örtüşmeyen görüntü düzlemleri, boyama varyasyonları ve fiziksel doku imha, örneğin, mikrotome bıçak. Buna karşılık, bozulmamış kalın doku örneklerinin saf optik Dilimleme çakışan görüntü düzlemleri (aşırı örnekleme) satın alma ve böylece, 3D yeniden yapılanma kolaylaştırır sağlar. Bu, sırayla, karmaşık hücre nüfuslarında enfeksiyon süreçlerinin analizi için son derece yararlıdır (örneğin, çevreleyen glial ve bağışıklık hücrelerinin bağlamında nöronal ağlar). Ancak, kalın doku bölümlerinin doğal engelleri doku içine ışık saçılma ve sınırlı antikor penetrasyonunu içerir. Son yıllarda, çeşitli teknikler geliştirilmiştir ve bu sorunların üstesinden gelmek için optimize edilmiştir2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 ‘ dan fazla , 11 ‘ i , 12 tane , 13. esasen, hedef dokular, sulu2,3,4,5,6,7 ile tedavi ile optik şeffaf olarak dönüşmüştür ,8,9 veya organik solvent bazlı10,11,12,13 çözümler. 3disco (solvent temizlenmiş organların 3B görüntüleme)11,12 ve onun halefi udisco (solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme) tanıtımı13 , nispeten hızlı, basit ve ucuz bir araç sağladı mükemmel temizleme yetenekleri. Temizleme protokolünün ana bileşenleri organik çözücüler tert-Butanol (TBA), Benzil alkol (BA), Benzil benzoat (BB) ve difenil eter (DPE) ‘ dir. Geliştirme ve iDISCO eklenmesi (solvent temizlenmiş organların immünolabeling-etkin 3D görüntüleme)14, uyumlu bir immünostat protokolü, mevcut yöntemler üzerinde başka bir avantaj oluşturdu ve antijenlerin derin doku etiketleme etkin hem de immünosteli numunelerin uzun süreli depolanması. Böylece, iDISCO14 ve udisco13 kombinasyonu, geleneksel CLSM kullanarak büyük doku bölümlerinde (1 mm ‘ye kadar) antikor etiketli proteinlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin sağlar.
Bir organın her üç boyutta kompleks yapısının korunması özellikle beyin dokusu için önemlidir. Nöronlar çok çeşitli 3D morfolojileri nörit projeksiyonlarına dayalı çok heterojen hücresel alt nüfus oluşturur (Masland tarafından gözden15). Ayrıca beyin, glial hücreler ve nöronlar (von Bartheld ve al.16tarafından gözden geçirilmiş) dahil olmak üzere farklı hücresel alt nüfus ve oranlardan oluşan bir dizi bölmeler ve alt bölmesinden oluşur. Bir nörotropik virüs olarak, kuduz virüsü (rabv, Fooks ve al.17tarafından gözden geçirilmiş) öncelikle nöronlar bozar, kendi taşıma makineleri kullanarak orta sinir sistemi (CNS) enfeksiyon birincil sitesinden akons boyunca retrograd yönde seyahat etmek. Burada açıklanan protokol (Şekil 1A) enfekte beyin dokusundan elde edilen büyük, tutarlı görüntü yığınlarında rabv ve rabv enfekte hücrelerin immünostal destekli algılama ve görselleştirme için izin verir. Bu, enfeksiyon ortamının tarafsız, 3D yüksek çözünürlüklü değerlendirmesini sağlar. Bu türlerin çeşitli beyin dokusu için uygulanabilir, tespit sonra hemen yapılabilir veya civarında formaldehite numunelerin uzun süreli depolama sonra (PFA), ve depolama ve ay için lekeli ve temizlenmiş numunelerin yeniden görüntüleme sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonyıllarda doku Temizleme tekniklerini canlandırmak ve daha da geliştirilmesi2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 ‘ dan fazla , 11 ‘ i , 12 tane , <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, yazının eleştirel okunması için Thomas C. Mettenleiter ve Verena te kamp ‘a teşekkür ederler. Bu çalışma Mecklenburg Batı Pomerania Federal mükemmellik girişimi ve Avrupa Sosyal Fonu (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) ve Lyssaviruses bir intramural işbirlikçi araştırma hibe tarafından destekleniyordu Friedrich-Loeffler-Enstitüsü (RI-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
