Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos
Summary
Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.
Abstract
Un aspecto clave de la respuesta inmune a la colonización bacteriana de la hostia es la fagocitosis. Un ensayo de matanza opsonofagocítico (OPKA) es un procedimiento experimental en el que las células fagocíticas son cultivadas conjuntamente con unidades bacterianas. Las células inmunes a fagocitar y matar los cultivos bacterianos en una forma dependiente de complemento. La eficacia de la muerte de la célula inmunitaria depende de varios factores y puede utilizarse para determinar bacterias diferentes culturas Comparar con respecto a la resistencia a la muerte celular. De esta manera, la eficacia de la terapéutica de base inmunitaria potencial puede ser evaluada contra cepas bacterianas específicas o serotipos. En este protocolo, describimos un OPKA simplificada que utiliza condiciones de cultivo básico y cuenta determinar la viabilidad de la célula bacteriana después de co-cultivo con condiciones de tratamiento y HL-60 células inmunes de la célula. Este método ha sido utilizado con éxito con un número de diferentes serotipos de neumococos, capsulares y cepas de acapsular y otras especies bacterianas. Las ventajas de este protocolo OPKA son su simplicidad, versatilidad (como este ensayo no se limita a los tratamientos de anticuerpo como opsoninas) y reducción al mínimo de tiempo y reactivos para evaluar grupos experimentales básicos.
Introduction
Opsonofagocítico matando a ensayo (OPKA) es una herramienta crítica para vincular alteraciones en la estructura bacteriana o función con cambios posteriores en la respuesta inmune y la función. Como tal, con frecuencia se utiliza como una prueba complementaria para determinar base inmunitaria la eficacia de los tratamientos de anticuerpo, candidatos vacunales, optimización de la enzima, etcetera. Mientras los ensayos in vivo son necesarios para determinar el margen de altura eficaz o la protección de un modelo de infección bacteriana, la OPKA puede utilizarse para evaluar contribución inmune a la muerte de la célula bacteriana más básicos componentes: bacterias, células inmunes y experimental tratamientos. Estudios anteriores han demostrado que OPKAs pueden ser modificados y utilizados para una variedad de bacterias y serotipos, incluyendo Streptococcus pneumoniae1,2de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa3. Además, estos ensayos optimizados pueden utilizarse para evaluar distintos tratamientos experimentales, incluyendo la capacidad de una enzima para que la bacteria sea más accesible a los tratamientos4 y anticuerpo complemento-mediada de las células inmunes para mejorar opsonización5. Clásico, ensayo OPKA se ha utilizado con éxito en investigación básica y clínica ajustes como un indicador de gran alcance para la protección inducida por anticuerpos patógenos específicos6,7,8,9 .
Diferentes tipos de células inmunes pueden usarse para evaluación de opsonofagocítico matar. Una población fagocítica comúnmente utilizada es la línea de células leucémicas humanas HL-60. Esta línea celular se puede mantener como promyelocytes inactivada en la cultura; sin embargo, puede ser distinguidos en varios Estados activados a través de diferentes drogas tratamientos10,11. Tratamiento de HL60 con N, N-dimetilformamida distingue la línea celular en neutrófilos activados con fuerte actividad fagocítica11. Mientras que las células HL-60 se han optimizado y se utilizan con frecuencia para estos ensayos de fagocitosis10, pueden utilizarse otros leucocitos polimorfonucleares primarios como el brazo inmune del experimento12.
Además, estos ensayos pueden ser simplificado13 o multiplexado14 mirar varias cepas resistentes a los antibióticos de la bacteria a probar. El método de multiplexado se ha hecho más factible a través del desarrollo de software que puede contar eficientemente Colonia bacteriana formando unidades (UFC) por spot en una placa de agar15. Aquí, describimos un método racionalizado usando una cepa bacteriana, las células HL-60, complemento de conejo bebé y placas de agar sangre. Con este método, varios tratamientos pueden ser evaluados rápidamente para hacer frente a preguntas de investigación específicas sobre cómo se pueden modular la respuesta inmune innata a la infección bacteriana.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs servir a funciones esenciales en la determinación de anticuerpo mediado inmune respuestas inducidas por vacunas6,8. La importancia principal de este OPKA simplificada es la adaptabilidad en las condiciones de prueba (es decir, anticuerpos, enzima tratamientos, etcetera.). En este sentido, mientras que este ensayo puede utilizarse para probar la contribución de opsoninas (es decir, anticuerpos) fagocitosis, puede también ser utilizado para evaluar formas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos su inestimable colaboración en el establecimiento de ensayos OPKA en nuestro laboratorio Dr. Moon Nahm (Universidad de Alabama Birmingham). Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1R01AI123383-01A1 a FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
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