病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ
Summary
この opsonophagocytic 殺害の試金を使用してに対応し、さまざまな治療法や条件に基づいている細菌を殺す免疫細胞の貪食能力を比較します。クラシック、この試金はオプソニンとして細菌に対する抗体のエフェクターの機能を評価するためのゴールド スタンダードとして提供しています。
Abstract
ホストの細菌の定着に対する免疫応答の重要な側面は、貪食能です。Opsonophagocytic 殺害アッセイ (OPKA) は、貪食細胞が細菌の単位との共培養実験手順です。免疫細胞が貪食し、補体依存的に細菌文化を殺します。免疫細胞の殺害の効率はいくつかの要因に依存して、どのように異なる細菌を決定する使用ことができます細胞死への抵抗についての文化を比較します。この方法では、血清型および/または特定の菌株に対して潜在的な免疫治療の有効性を評価できます。このプロトコルでは基本的な培養条件と細胞治療条件および HL 60 免疫細胞との共培養後細菌の細胞の生存率を決定するカウントを利用して簡易 OPKA をについて説明します。このメソッドは、正常に数の異なる肺炎球菌血清型、被膜と acapsular 株と他の細菌種に利用されています。この OPKA プロトコルの利点は、そのシンプルさ、汎用性 (このアッセイは、オプソニンとして抗体治療に限定されない)、時間および基本的な実験グループを評価するために試薬の最小化。
Introduction
試金 (OPKA) を殺す opsonophagocytic は細菌の構造や機能の変化を免疫反応と機能の後の変化にリンクするための重要なツールです。など、それは頻繁に相補的なアッセイとして抗体治療、ワクチン候補、酵素の最適化などの免疫系の有効性を判断する使用されます。細菌の細胞死への免疫の最も基本的なコンポーネントを評価するために、OPKA を使用できます in vivo アッセイは効果的なクリアランスや細菌感染症モデルの保護を確認する必要が、: 細菌、免疫細胞、および実験トリートメント。前の研究は、OPKAs の変更および様々 な細菌と肺炎球菌1、2黄色ブドウ球菌、緑膿菌3を含む血清型に使用できることを示しています。さらに、これらの最適化されたアッセイは細菌を改善するために免疫細胞の補体を介した4と抗体治療をよりアクセシブルにする酵素の機能を含むさまざまな実験的治療法を評価するために使用できます。オプソニン化5。古典的な OPKA のアッセイは正常に基礎および臨床研究で使用されている病原体特異的抗体6,7,8,9による保護のための強力な指標として設定.
免疫細胞の種類は、opsonophagocytic の殺害の評価のために使えます。1 つの一般的に使用される貪食人口は HL 60 ひと白血病細胞株である.この細胞株は文化で不活化前骨髄球として保つことができます。しかし、彼らは、異なる薬物治療10,11を介してさまざまな活性化状態に区別できます。N HL60 の治療、ジメチルホルムアミドは、強い貪食能11活性化好中球に細胞を区別します。HL ‐ 60 細胞に最適化されている、これらの食作用の試金10によく使用されますが、他のプライマリの多形核白血球は免疫実験12の腕として使用できます。
さらに、これらの試簡体字13または14を見てテストする細菌の抗生物質耐性菌の複数を多重化します。多重はより効率的に寒天プレート15スポットあたり単位 (CFUs) を形成する細菌のコロニーを数えることができるソフトウェアの開発を可能にしました。ここでは、1 つの菌株、HL 60 細胞、赤ちゃんウサギ補完、血液寒天培地プレートを使用して合理化された手法について述べる。この方法では、複数の治療法を特定細菌感染に対する自然免疫応答を変調することができますどのように疑問に対処するため迅速に評価できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs は、予防接種6,8抗体による免疫反応を評価する上で重要な役割を果たします。この簡略化された OPKA の主要な意義はテストされる条件の適応性 (すなわち、抗体、酵素治療、等)。この意味で、このアッセイは、貪食、オプソニン (すなわち、抗体) の貢献をテストする使用できますがそれも使えます通常貪食経路を阻害する病原因子 (すなわち?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
当研究室の OPKA 試金の確立に彼の非常に貴重な援助ありがとう博士月 Nahm (アラバマ大学バーミンガム)。この作品は、FYA を国内機関の健康の付与 1R01AI123383 01A1 によって支えられました。
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
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