Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים
Summary
שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.
Abstract
היבט מרכזי של התגובה החיסונית מושבת חיידקים של הפונדקאי היא phagocytosis. Assay הריגה opsonophagocytic (OPKA) הוא תהליך ניסוי שבו תאים phagocytic הם תרבותי משותף עם יחידות חיידקי. תאים חיסוניים phagocytose ולהרוג את התרבויות חיידקי באופן תלוי-המשלים. היעילות של ההרג בתיווך החיסון התא תלויה במספר גורמים, והוא יכול לשמש כדי לקבוע כמה שונה בקטריאלי תרבויות להשוות מבחינת עמידות בפני מוות של תאים. בדרך זו, וצריך להעריך את היעילות של פוטנציאל הרפוי המבוסס על החיסון נגד זני חיידקים ספציפיים ו/או אשר נגרמו מהזנים אליהם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים OPKA מפושטת אשר מנצל תנאים בסיסיים תרבות ותא לספור כדי לקבוע את הכדאיות תא החיידק אחרי תרבות משותפת עם הטיפול והתנאים תאים חיסוניים HL-60. בשיטה זו יש כבר מנוצל בהצלחה עם מספר שונה pneumococcal אשר נגרמו מהזנים אליהם, הסיבה acapsular זנים, ואת מיני חיידקים אחרים. היתרונות של פרוטוקול זה OPKA הם הפשטות שלה, צדדיות (כמו assay זו אינה מוגבלת נוגדן טיפולים כמו opsonins), ומינימיזציה של ריאגנטים להעריך קבוצות מעבדה בסיסית וזמן.
Introduction
Opsonophagocytic הורגת assay (OPKA) הוא כלי חיוני עבור קישור שינויים במבנה חיידקי או פונקציה לשינויים הבאים התגובה החיסונית ותפקוד. ככזה, הוא משמש לעתים קרובות כמו assay משלימים כדי לקבוע המבוסס על החיסון יעילותם של טיפולים נוגדן, חיסון מועמדים, אנזים אופטימיזציה, וכו ‘. בזמן מבחני ויוו נחוצים לקבוע סיווג יעיל או הגנה במודל של זיהום חיידקי, OPKA יכול לשמש כדי להעריך את התרומה חסין מוות תאים חיידקיים מרכיבים בסיסיים ביותר: חיידקים, תאי מערכת החיסון, וניסויים טיפולים. מחקרים קודמים הראו כי OPKAs יכול להיות שונה, המשמש למגוון רחב של חיידקים, אשר נגרמו מהזנים אליהם, כולל סטרפטוקוקוס pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. יתר על כן, מבחני ממוטבת אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את ניסיוני טיפולים שונים, כולל היכולת של אנזים לגרום החיידק יותר נגיש4 תאים חיסוניים בתיווך המשלים וטיפולי נוגדנים כדי לשפר opsonization5. באופן קלאסי, OPKA assay בהצלחה שימש במחקר בסיסי וקליני הגדרות כמו מחוון עוצמה להגנה המושרה על ידי נוגדנים ספציפיים הפתוגן6,7,8,9 .
סוגים שונים של תאים חיסוניים עשוי לשמש להערכה של opsonophagocytic רצח. אוכלוסייה אחת phagocytic נפוץ הוא הקו תאי לוקמיה אדם HL-60. קו תא זה יכול להישמר כמו promyelocytes מוחלש בתרבות; עם זאת, הם יכול להיות מובחן המצבים השונים מופעל באמצעות סמים שונים טיפולים10,11. טיפול של HL60 עם N, N-dimethylformamide מבדילה את שורת התאים לתוך נויטרופילים הופעל עם פעילות חזקה phagocytic11. בעוד HL-60 תאים מוטבו משמשים לעתים קרובות אלה מבחני phagocytosis10, לויקוציטים אורך חייהם העיקרית אחרים יכול לשמש כזרוע המערכת החיסונית הניסוי12.
בנוסף, מבחני אלה יכולה להיות מפושטת13 או מרובב14 להסתכל על מספר זנים עמידים לאנטיביוטיקה של החיידק להיבדק. השיטה מרובבת נעשה יותר ריאלי דרך פיתוח תוכנה יעילה יכולה לסמוך מושבת חיידקים ויוצרים יחידות (CFUs) לכל נקודה על מטוס צלחת אגר15. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה באמצעות אחד זן חיידקי, HL-60 תאים, המשלים ארנב התינוק פלטות אגר דם. בשיטה זו, טיפולים מרובים יכולים להיות מוערך במהירות כדי לטפל שאלות מחקר ספציפי על איך יכול להיות מאופנן התגובה החיסונית מולדת זיהום חיידקי.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs מגישים תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות מתווכת נוגדן המושרה על ידי חיסונים6,8. המשמעות העיקרית של OPKA פשוטה זו היא הסתגלות, בתנאים להיבדק (קרי, נוגדנים, אנזימים טיפולים, וכו ‘.). במובן זה, בעוד assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את התרומה של opsonins (קרי, נוגדנים) phag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר מון Nahm (אוניברסיטת אלבמה ברמינגהם) על שלו בפז סיוע בהקמת OPKA מבחני במעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1R01AI123383-01A1 כדי FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
